Đồng nghĩa từPCR( sinh vật học đích tụ hợp môi liên phản ứng ) nhất bàn chỉ tụ hợp môi liên thức phản ứng
Tụ hợp môi liên thức phản ứng ( PCR ) thị nhất chủng dụng vu phóng đại khoách tăng đặc định đích DNA phiến đoạn đíchPhân tử sinh vật học kỹ thuật,Tha khả khán tác thị sinh vật thể ngoại đích đặc thù DNA phục chế, PCR đích tối đại đặc điểm thị năng tương vi lượng đích DNA đại phúc tăng gia. Nhân thử, vô luận thị hóa thạch trung đích cổ sinh vật, lịch sử nhân vật đích tàn hài, hoàn thị kỉ thập niên tiền hung sát án trung hung thủ sở di lưu đích mao phát, bì phu hoặc huyết dịch, chỉ yếu năng phân ly xuất nhất đinh điểm đíchDNA,Tựu năng dụng PCR gia dĩ phóng đại, tiến hành bỉ đối. Giá dã thị “Vi lượng chứng cư” đích uy lực chi sở tại. Do 1983 niên mỹ quốc Mullis thủ tiên đề xuất thiết tưởng, 1985 niên do kỳ phát minh liễu tụ hợp môi liên phản ứng, tức giản dịch DNA khoách tăng pháp, ý vị trứ PCR kỹ thuật đích chân chính đản sinh. Đáo như kim 2013 niên, PCR dĩ phát triển đáo đệ tam đại kỹ thuật. 1976 niên, trung quốc khoa học gia tiền gia vận, phát hiện liễu ổn định đích Taq DNA tụ hợp môi, vi PCR kỹ thuật phát triển dã tố xuất liễu cơ sở tính cống hiến.
PCR thị lợi dụngDNATại thể ngoại nhiếp thị 95° cao ôn thời biến tính hội biến thành đan liên, đê ôn ( kinh thường thị 60°C tả hữu ) thời dẫn vật dữ đan liên ánDảm cơHỗ bổ phối đối đích nguyên tắc kết hợp, tái điềuÔn độChí DNA tụ hợp môi tối thích phản ứng ôn độ ( 72°C tả hữu ), DNATụ hợp môiDuyên trứ lân toan đáo ngũ thán đường (5'-3') đích phương hướng hợp thành hỗ bổ liên. Cơ vu tụ hợp môi chế tạo đích PCR nghi thật tế tựu thị nhất cá ôn khống thiết bị, năng tại biến tính ôn độ, phục tính ôn độ, diên thân ôn độ chi gian ngận hảo địa tiến hành khống chế.[1]
- Trung văn danh
- Tụ hợp môi liên thức phản ứng
- Ngoại văn danh
- Polymerase Chain Reaction
- Giản xưng
- PCR
- Chúc tính
- Liên thức phản ứng
- Mục tiền trạng thái
- Đệ tam đại kỹ thuật
- Đề xuất nhân
- Mục lợi tư[2]
Mục lục
- 1PCR đích sang kiến
- 2PCR nguyên lý
- 3Phản ứng chuẩn bị
- ▪PCR phản ứng thể hệ
- ▪PCR dẫn vật thiết kế
- ▪Mô bản đích chế bị
- ▪Phản ứng đích khống chế
- 4Tuần hoàn tham sổ
- ▪Dự biến tính
- ▪Biến tính bộ sậu
- ▪Dẫn vật thối hỏa
- ▪Dẫn vật diên thân
- ▪Tuần hoàn sổ
- ▪Tối hậu diên thân
- 5Bộ sậu
- 6Kiểm trắc
- 7Phản ứng đặc điểm
Khorana (1971) đẳng tối tảo đề xuấtHạch toanThể ngoại khoách tăng đích thiết tưởng: “KinhDNA biến tính,Dữ hợp thích đích dẫn vậtTạp giao,DụngDNA tụ hợp môiDiên nghênh điếm thân dẫn vật, tịnh bất đoạn trọng phục hãn thi chỉ điếm cai thịnh cục nhã quá trình tiện khả hợp thành tRNA cơ nhân.”
Đãn do vu đương thời cơ nhân tự liệt phân tích phương pháp thượng vị thành thục, nhiệt ổn định DNA tụ hợp môi thượng vị báo đạo dĩ cập dẫn vật hợp lệ khứ bảng thành đích khốn nan, giá chủng tưởng pháp tự hồ một hữu thật tế ý nghĩa. Gia thượng phân tử khắc long kỹ thuật đích xuất hiện đề cung liễu nhất chủng khắc long hòa khoách tăng cơ nhân đích đồ kính, sở dĩ Khorana đích thiết tưởng bị nhân môn di vong liễu.
1983 niên 4 nguyệt đích nhất cá tinh kỳ ngũ vãn thượng, tha khai xa khứ hương hạ biệt thự đích lộ thượng, mãnh nhiên thiểm hiện xuất “Đa tụ môi liên thức phản ứng” đích tưởng pháp.
1983 niên 12 nguyệt, Mullis dụng đồng vị tố tiêu ký pháp khán đáo liễu 10 cá tuần hoàn hậu đích đổng thể phóng 49 bp trường độ hàn chương đích đệ nhất cá P đà sao hạ CR phiến đoạn;
1985 niên, Kary Mullis tại Cetus công tư công tác kỳ gian, phát minh liễu PCR. Mullis yếu hợp thành DNA dẫn vật lai tiến hành trắc tự công tác, khước thường vi một hữu túc cú đa đích mô bản DNA nhi phiền não.
1985 niên 10 nguyệt 25 nhật thân thỉnh kỉ dân tiết liễu PCR đích chuyên lợi, 1987 niên 7 nguyệt 28 nhật phê chuẩn ( chuyên lợi hào 4,683,202 ), Mullis thị đệ nhất phát minh nhân;
1985 niên 12 nguyệt 20 nhật tại Science tạp chí thượng phát biểu liễu đệ nhất thiên PCR đích học thuật luận văn, Mullis thị cộng đồng tác giả;
1986 niên 5 nguyệt, Mullis tại lãnh tuyền cảng thật nghiệm thất tố chuyên đề báo cáo, toàn thế giới tòng thử khai thủy học tập PCR đích phương pháp.[1]
DNA đíchBán bảo lưu phục chếThị sinh vật tiến hóa hòa truyện đại đích trọng yếu đồ kính. Song liên DNA tại đa chủng môi đích tác dụng hạ khả dĩ biến tínhGiải toànThành đan liên, tại DNA tụ hợp môi đích tham dữ hạ, căn cưDảm cơ hỗ bổ phối đối nguyên tắcPhục chế thành đồng dạng đích lưỡng phân tử khảo bối. Tại thật nghiệm trung phát hiện, DNA tạiCao ônThời dã khả dĩ phát sinh biến tính giải liên, đương ôn độ hàng đê hậu hựu khả dĩPhục tínhThành viSong liên.Nhân thử, thông quá ôn độ biến hóa khống chế DNA đích biến tính hòa phục tính, gia nhập thiết kếDẫn vật,DNA tụ hợp môi, dNTP tựu khả dĩ hoàn thành đặc định cơ nhân đích thể ngoại phục chế.
Đãn thị, DNA tụ hợp môi tại cao ôn thời hội thất hoạt, nhân thử, mỗi thứ tuần hoàn đô đắc gia nhập tân đích DNA tụ hợp môi, bất cận thao tác phiền tỏa, nhi thả giới cách ngang quý, chế ước liễu PCR kỹ thuật đích ứng dụng hòa phát triển.
Nại nhiệt DNA tụ hợp môi -Taq môi đích phát hiện đối vu PCR đích ứng dụng hữu lí trình bi đích ý nghĩa, cai môi khả dĩ nại thụ 90℃ dĩ thượng đích cao ôn nhi bất thất hoạt, bất nhu yếu mỗi cá tuần hoàn gia môi, sử PCR kỹ thuật biến đắc phi thường giản tiệp, đồng thời dã đại đại hàng đê liễu thành bổn, PCR kỹ thuật đắc dĩ đại lượng ứng dụng, tịnh trục bộ ứng dụng vu lâm sàng.
PCR kỹ thuật đích cơ bổn nguyên lý loại tự vu DNA đích thiên nhiên phục chế quá trình, kỳ đặc dị tính y lại vu dữ bá tự liệt lưỡng đoan hỗ bổ đích quả hạch đại toan dẫn vật. PCR do biến tính - thối hỏa - diên thân tam cá cơ bổn phản ứng bộ sậu cấu thành: ① mô bản DNA đích biến tính: Mô bản DNA kinh gia nhiệt chí 93℃ tả hữu nhất định thời gian hậu, sử mô bản DNASong liênHoặc kinh PCR khoách tăng hình thành đích song liên DNA giải ly, sử chi thành vi đan liên, dĩ tiện tha dữ dẫn vật kết hợp, vi hạ luân phản ứng tác chuẩn bị; ② mô bản DNA dữ dẫn vật đích thối hỏa (Phục tính): Mô bản DNA kinh gia nhiệt biến tính thành đan liên hậu, ôn độ hàng chí 55℃ tả hữu, dẫn vật dữ mô bản DNA đan liên đíchHỗ bổ tự liệtPhối đối kết hợp; ③ dẫn vật đích diên thân: DNA mô bản - dẫn vật kết hợp vật tại 72℃,DNA tụ hợp môi( như TaqDNA tụ hợp môi ) đích tác dụng hạ, dĩ dNTP vi phản ứng nguyên liêu, bá tự liệt vi mô bản, ánDảm cơ hỗ bổ phối đốiDữ bán bảo lưu phục chế nguyên lý, hợp thành nhất điều tân đích dữ mô bản DNA liên hỗ bổ đích bán bảo lưu phục chế liên, trọng phục tuần hoàn biến tính - thối hỏa - diên thân tam quá trình tựu khả hoạch đắc canh đa đích “Bán bảo lưu phục chế liên”, nhi thả giá chủng tân liên hựu khả thành vi hạ thứ tuần hoàn đích mô bản. Mỗi hoàn thành nhất cá tuần hoàn nhu 2～4 phân chung, 2～3 tiểu thời tựu năng tương đãi khoáchMục đích cơ nhânKhoách tăng phóng đại kỉ bách vạn bội.[3]
10× khoách tăng hoãn trùng dịch | 10μl |
4 chủng dNTP hỗn hợp vật ( chung nùng độ ) | Các 100～250μmol/L |
Dẫn vật ( chung nùng độ ) | Các 5～20μmol/L |
Mô bản DNA | 0.1～2μg |
Taq DNA tụ hợp môi | 5～10 U |
Mg2+( chung nùng độ ) | 1～3mmol/L |
Bổ gia song chưng thủy | 100 μl |
Kỳ trung dNTP, dẫn vật, mô bản DNA, Taq DNA tụ hợp môi dĩ cập Mg2+Đích gia lượng ( hoặc nùng độ ) khả căn cư thật nghiệm điều chỉnh, dĩ thượng biểu cách chỉ đề cung đại trí tham khảo trị.
PCR phản ứng ngũ yếu tố: Tham gia PCR phản ứng đích vật chất chủ yếu hữu ngũ chủng tức: Dẫn vật ( PCR dẫn vật vi DNA phiến đoạn, tế bào nội DNA phục chế đích dẫn vật vi nhất đoạn RNA liên ), môi, dNTP, mô bản hòa hoãn trùng dịch ( kỳ trung nhu yếu Mg2+).
Dẫn vật hữu đa chủng thiết kế phương pháp, do PCR tại thật nghiệm trung đích mục đích quyết định, đãn cơ bổn nguyên tắc tương đồng. PCR sở dụng đích môi chủ yếu hữu lưỡng chủng lai nguyên: Taq hòa Pfu, phân biệt lai tự lưỡng chủng bất đồng đích phệ nhiệt khuẩn. Kỳ trung Taq khoách tăng hiệu suất cao đãn dịch phát sinhThác phối.Pfu khoách tăng hiệu suất nhược đãn hữu củ thác công năng. Sở dĩ thật tế sử dụng thời căn cư nhu yếu tất tu tố bất đồng đích tuyển trạch.
Mô bản tức khoách tăng dụng đích DNA, khả dĩ thị nhậm hà lai nguyên, đãn hữu lưỡng cá nguyên tắc, đệ nhất thuần độ tất tu giác cao, đệ nhị nùng độ bất năng thái cao dĩ miễn ức chế.
Hoãn trùng dịch đích thành phân tối vi phục tạp, trừ thủy ngoại nhất bàn bao quát tứ cá hữu hiệu thành phân: Hoãn trùng thể hệ, nhất bàn sử dụng HEPES hoặc MOPS hoãn trùng thể hệ; nhất giới dương ly tử, nhất bàn thải dụng giáp ly tử, đãn tại đặc thù tình huống hạ dã khả sử dụng an căn ly tử; nhị giới dương ly tử, tức mĩ ly tử, căn cư phản ứng thể hệ xác định, trừ đặc thù tình huống ngoại bất nhu điều chỉnh; phụ trợ thành phân, thường kiến đích hữu DMSO, cam du đẳng, chủ yếu dụng lai bảo trì môi đích hoạt tính hòa bang trợ DNA giải trừ triền nhiễu kết cấu.[3]
PCR phản ứng trung hữu lưỡng điều dẫn vật, tức 5′ đoan dẫn vật hòa 3′ dẫn vật. Thiết kế dẫn vật thời dĩ nhất điều DNA đan liên vi cơ chuẩn ( thường dĩ tín tức liên vi cơ chuẩn ), 5′ đoan dẫn vật dữ vị vu đãi khoách tăng phiến đoạn 5′ đoan thượng đích nhất tiểu đoạn DNA tự liệt tương đồng; 3′ đoan dẫn vật dữ vị vu đãi khoách tăng phiến đoạn 3′ đoan đích nhất tiểu đoạn DNA tự liệt hỗ bổ.
( 1 ) dẫn vật thiết kế đích cơ bổn nguyên tắc
- Dẫn vật trường độ: 15-30bp, thường dụng vi 20bp tả hữu.
- Dẫn vật dảm cơ: G+C hàm lượng dĩ 40-60% vi nghi, G+C thái thiếu khoách tăng hiệu quả bất giai, G+C quá đa dịch xuất hiện phi đặc dị điều đái. ATGC tối hảoTùy cơ phân bố,Tị miễn 5 cá dĩ thượng đíchPhiêu lánhHoặcMật định hạch đại toanĐích thành xuyến bài liệt tham chiếu.
- Dẫn vật nội bộ bất ứng xuất hiện hỗ bổ tự liệt.
- Lưỡng cá dẫn vật chi gian bất ứng tồn tại hỗ bổ tự liệt, vưu kỳ thị tị miễn 3 ′ đoan đích hỗ bổ trọng điệp.
- Dẫn vật dữ phi đặc dị khoách tăng khu đích tự liệt đích đồng nguyên tính bất yếu siêu quá 70%, dẫn vật 3′ mạt đoan liên tục 8 cá dảm cơ tại đãi khoách tăng khu dĩ ngoại bất năng hữu hoàn toàn hỗ bổ tự liệt, phủ tắc dịch đạo trí phi đặc dị tính khoách tăng.
- Dẫn vật 3‘ đoan đích dảm cơ, đặc biệt thị tối mạt cập đảo sổ đệ nhị cá dảm cơ, ứng nghiêm cách yếu cầu phối đối, tối giai tuyển trạch thị G hòa C.
- Dẫn vật đích 5′ đoan khả dĩ tu sức. Như phụ gia hạn chế môi vị điểm, dẫn nhập đột biến vị điểm, dụng sinh vật tố, huỳnh quang vật chất, địa cao tân tiêu ký, gia nhập kỳ tha đoản tự liệt, bao quátKhởi thủy mật mã tử,Chung chỉ mật mã tửĐẳng.
( 2 ) dẫn vật thiết kế nhuyễn kiện
- Primer Premier5.0 ( tự động sưu tác )
- vOligo6 ( dẫn vật bình giới )
- vVector NTI Suit
- vDNAsis
- vOmiga
- vDNAstar
- vPrimer3 ( tại tuyến phục vụ )
Mô bản đích thủ tài chủ yếu y cư PCR đích khoách tăng đối tượng, khả dĩ thịBệnh nguyên thểTiêu bổn nhưBệnh độc,Tế khuẩn,Chân khuẩnĐẳng. Dã khả dĩ thịBệnh lýSinh lýTiêu bổn nhưTế bào,Huyết dịch,Dương thủyTế bào đẳng.Pháp y họcTiêu bổn hữuHuyết ban,Tinh ban,Mao phát đẳng.
Tiêu bổn xử lý đích cơ bổn yếu cầu thị trừ khứ tạp chất, tịnh bộ phân thuần hóa tiêu bổn trung đích hạch toan. Đa sổ dạng phẩm nhu yếu kinh quá SDS hòaĐản bạch môiK xử lý. Nan dĩ phá toái đích tế khuẩn, khả dụngDung khuẩn môiGia EDTA xử lý. Sở đắc đáo đích thô chế DNA, kinh phân, lục phảng trừu đề thuần hóa, tái dụng ất thuần trầm điến hậu dụng tác PCR phản ứng mô bản.
- PCR phản ứng đích hoãn trùng dịch đề cung hợp thích đích toan dảm độ dữ mỗ ta ly tử
- Mĩ ly tử nùng độ tổng lượng ứng bỉ dNTPs đích nùng độ cao, thường dụng 1.5mmol/L
- Để vật nùng độ dNTP dĩ đẳng ma nhĩ nùng độ phối chế, 20～200umol/L
- TaqDNA tụ hợp môi 2.5U ( 100ul )
- Dẫn vật nùng độ nhất bàn vi 0.1 ～ 0.5umol/L
- Phản ứng ôn độ hòa tuần hoàn thứ sổ
Biến tính ôn độ hòa thời gian 95℃, 30s
Thối hỏa ôn độ hòa thời gian đê vu dẫn vật Tm trị 5 ℃ tả hữu, nhất bàn tại 45～55℃
Diên thân ôn độ hòa thời gian 72℃, 1min/kb ( 10kb nội )
Tm trị =4(G+C) +2(A+T)
Tuần hoàn thứ sổ: Nhất bàn vi 25 ～ 30 thứ. Tuần hoàn sổ quyết định PCR khoách tăng đích sản lượng. Mô bản sơ thủy nùng độ đê, khả tăng gia tuần hoàn sổ dĩ tiện đạt đáo hữu hiệu đích khoách tăng lượng. Đãn tuần hoàn sổ tịnh bất thị khả dĩ vô hạn tăng gia đích. Nhất bàn tuần hoàn sổ vi 30 cá tả hữu, tuần hoàn sổ siêu quá 30 cá dĩ hậu, DNA tụ hợp môi hoạt tính trục tiệm đạt đáo bão hòa, sản vật đích lượng bất tái tùy tuần hoàn sổ đích tăng gia nhi tăng gia, xuất hiện liễu sở vị đích “Bình đài kỳ”.[4]
Mô bản DNA hoàn toàn biến tính dữ PCR môi đích hoàn toàn kích hoạt đối PCR năng phủ thành công chí quan trọng yếu, kiến nghị gia nhiệt thời gian tham khảo thí tề thuyết minh thư, nhất bàn vị tu sức đích Taq môi kích hoạt thời gian vi lưỡng phân chung.[5]
Tuần hoàn trung nhất bàn 95℃, 30 miểu túc dĩ sử các chủng bá DNA tự liệt hoàn toàn biến tính, khả năng đích tình huống hạ khả súc đoản cai bộ sậu thời gian. Biến tính thời gian quá trường tổn hại môi hoạt tính, quá đoản bá tự liệt biến tính bất triệt để, dịch tạo thành khoách tăng thất bại.[5]
Thối hỏa ôn độ nhu yếu tòng đa phương diện khứ quyết định, nhất bàn căn cư dẫn vật đích Tm trị vi tham khảo, căn cư khoách tăng đích trường độ thích đương hạ điều tác vi thối hỏa ôn độ. Nhiên hậu tại thử thứ thật nghiệm cơ sở thượng tố xuất dự cổ. Thối hỏa ôn độ đối PCR đích đặc dị tính hữu giác đại ảnh hưởng.[5]
Dẫn vật diên thân nhất bàn tại 72℃ tiến hành ( Taq môi tối thích ôn độ ). Đãn tại khoách tăng trường độ giác đoản thảThối hỏa ôn độGiác cao thời, bổn bộ sậu khả tỉnh lược diên thân thời gian tùy khoách tăng phiến đoạn trường đoản nhi định, nhất bàn thôi tiến tại 1000bp dĩ thượng, hàm Pfu cập kỳ diễn sinh vật đích diễn sinh thiết định vi 1min/kbp.[5]
Đại đa sổ PCR hàm 25-35 tuần hoàn, quá đa dịch sản sinh phi đặc dị khoách tăng.[5]
Tại tối hậu nhất cá tuần hoàn hậu, phản ứng tại 72℃ duy trì 10-30 phân chung ． sử dẫn vật diên thân hoàn toàn, tịnh sử đan liên sản vật thối hỏa thành song liên.[5]
Tiêu chuẩn đích PCR quá trình phân vi tam bộ:
DNA biến tính: ( 90℃-96℃ ):Song liênDNA mô bản tại nhiệt tác dụng hạ,Khinh kiệnĐoạn liệt, hình thành đan liên DNA
Thối hỏa: ( 60℃-65℃ ): Hệ thống ôn độ hàng đê, dẫn vật dữ DNA mô bản kết hợp, hình thành cục bộ song liên.
Diên thân: ( 70℃-75℃ ): TạiTaq môi( tại 72℃ tả hữu, hoạt tính tối giai ) đích tác dụng hạ, dĩ dNTP vi nguyên liêu, tòng dẫn vật đích 3′ đoan khai thủy dĩ tòng 5′→3′ đoan đích phương hướng diên thân, hợp thành dữ mô bản hỗ bổ đích DNA liên.
Mỗi nhất tuần hoàn kinh quá biến tính,Thối hỏaHòa diên thân, DNA hàm lượng tức tăng gia nhất bội. Như đồ sở kỳ: Hiện tại hữu ta PCR nhân vi khoách tăng khu ngận đoản, tức sử Taq môi hoạt tính bất thị tối giai dã năng tại ngận đoản đích thời gian nội phục chế hoàn thành, nhân thử khả dĩ cải vi lưỡng bộ pháp, tức thối hỏa hòa diên thân đồng thời tại 60℃-65℃ gian tiến hành, dĩ giảm thiếu nhất thứ thăng hàng ôn quá trình, đề cao liễu phản ứng tốc độ.[5]
PCR phản ứng khoách tăng xuất liễu cao đích khảo bối sổ, hạ nhất bộ kiểm trắc tựu thành liễu quan kiện.Huỳnh quang tố(Xú hóa ất đĩnh,EB) nhiễm sắcNgưng giao điện vịnhThị tối thường dụng đích kiểm trắc thủ đoạn. Điện vịnh pháp kiểm trắc đặc dị tính thị bất thái cao đích, nhân thử dẫn vật lưỡng tụ thể đẳng phi đặc dị tính đíchTạp giao thểNgận dung dịch dẫn khởi ngộ phán. Đãn nhân vi kỳ giản tiệp dịch hành, thành vi liễu chủ lưu kiểm trắc phương pháp. Cận niên lai dĩHuỳnh quang tham châmVi đại biểu đích kiểm trắc phương pháp, hữu trục tiệm thủ đại điện vịnh pháp đích xu thế.[5]
PCR phản ứng đích đặc dị tính quyết định nhân tố vi:
① dẫn vật dữ mô bản DNA đặc dị chính xác đích kết hợp;
② dảm cơ phối đối nguyên tắc;
③Taq DNA tụ hợp môi hợp thành phản ứng đích trung thật tính;
④ bá cơ nhân đích đặc dị tính dữ bảo thủ tính.
Kỳ trung dẫn vật dữ mô bản đích chính xác kết hợp thị quan kiện. Dẫn vật dữ mô bản đích kết hợp cập dẫn vật liên đích diên thân thị tuân tuầnDảm cơ phối đốiNguyên tắc đích. Tụ hợp môi hợp thành phản ứng đích trung thật tính cập TaqDNA tụ hợp môi nại cao ôn tính, sử phản ứng trung mô bản dữ dẫn vật đích kết hợp (Phục tính) khả dĩ tại giác cao đích ôn độ hạ tiến hành, kết hợp đíchĐặc dị tínhĐại đại tăng gia, bị khoách tăng đích báCơ nhân phiến đoạnDã tựu năng bảo trì ngận cao đíchChính xác độ.Tái thông quá tuyển trạch đặc dị tính hòa bảo thủ tính cao đích bá cơ nhân khu, kỳ đặc dị tính trình độ tựu canh cao.
PCR sản vật đích sinh thành lượng thị dĩ chỉ sổ phương thức tăng gia đích, năng tươngBì khắc( pg=10-12 ) lượng cấp đích khởi thủy đãi trắc mô bản khoách tăng đáo vi khắc ( μg=-6 ) thủy bình. Năng tòng 100 vạn cá tế bào trung kiểm xuất nhất cá bá tế bào; tại bệnh độc đích kiểm trắc trung, PCR đích linh mẫn độ khả đạt 3 cá RFU (Không ban hình thành đan vị); tạiTế khuẩn họcTrung tối tiểu kiểm xuất suất vi 3 cá tế khuẩn.[1]
PCR phản ứng dụng nại cao ôn đích Taq DNA tụ hợp môi, nhất thứ tính địa tương phản ứng dịch gia hảo hậu, tức tại DNA khoách tăng dịch hòa thủy dục oa thượng tiến hành biến tính - thối hỏa - diên thân phản ứng, nhất bàn tại 2～4 tiểu thời hoàn thành khoách tăng phản ứng. Khoách tăng sản vật nhất bàn dụngĐiện vịnh phân tích,Bất nhất định yếu dụngĐồng vị tố,Vô phóng xạ tính ô nhiễm, dịch thôi quảng.
Bất nhu yếu phân ly bệnh độc hoặc tế khuẩn cập bồi dưỡng tế bào, DNA thô chế phẩm cập RNA quân khả tác vi khoách tăng mô bản. Khả trực tiếp dụng lâm sàng tiêu bổn như huyết dịch,Thể khang dịch,Tẩy thấu dịch, mao phát, tế bào, hoạt tổ chức đẳng DNA khoách tăng kiểm trắc.[1]
PCR sản vật đích điện vịnh kiểm trắc thời gian nhất bàn vi 48h dĩ nội, hữu ta tối hảo vu đương nhật điện vịnh kiểm trắc, đại vu 48h hậu đái hình bất quy tắc thậm chí tiêu thất.
Bất xuất hiện khoách tăng điều đái. PCR phản ứng đích quan kiện hoàn tiết hữu ① mô bản hạch toan đích chế bị, ② dẫn vật đích chất lượng dữ đặc dị tính, ③ môi đích chất lượng cập xú ất đĩnh đích sử dụng, ④PCR tuần hoàn điều kiện. Tầm trảo nguyên nhân diệc ứng châm đối thượng thuật hoàn tiết tiến hành phân tích nghiên cứu.
Mô bản: ① mô bản trung hàm hữu tạp đản bạch chất, ② mô bản trung hàm hữu Taq môi ức chế tề, ③ mô bản trung đản bạch chất một hữu tiêu hóa trừ tịnh, đặc biệt thị nhiễm sắc thể trung đích tổ đản bạch, ④ tại đề thủ chế bị mô bản thời đâu thất quá đa, hoặc hấp nhập phân. ⑤ mô bản hạch toan biến tính bất triệt để. Tại môi hòa dẫn vật chất lượng hảo thời, bất xuất hiện khoách tăng đái, cực hữu khả năng thị tiêu bổn đích tiêu hóa xử lý, mô bản hạch toan đề thủ quá trình xuất liễu mao bệnh, nhân nhi yếu phối chế hữu hiệu nhi ổn định đích tiêu hóa xử lý dịch, kỳ trình tự diệc ứng cố định bất nghi tùy ý canh cải.[1]
Nhu chú ý đích thị hữu thời vong gia Taq môi hoặc xú ất đĩnh. Dẫn vật: Dẫn vật chất lượng, dẫn vật đích nùng độ, lưỡng điều dẫn vật đích nùng độ thị phủ đối xưng, thị PCR thất bại hoặc khoách tăng điều đái bất lý tưởng, dung dịch di tán đích thường kiến nguyên nhân. Hữu taPhê hàoĐíchDẫn vật hợp thànhChất lượng hữu vấn đề, lưỡng điều dẫn vật nhất điều nùng độ cao, nhất điều nùng độ đê, tạo thành đê hiệu suất đích bất đối xưng khoách tăng, đối sách vi: ① tuyển định nhất cá hảo đích dẫn vật hợp thành đan vị. ② dẫn vật đích nùng độ bất cận yếu khán OD trị, canh yếu chú trọng dẫn vật nguyên dịch tốQuỳnh chi đường ngưng giao điện vịnh,Nhất định yếu hữu dẫn vật điều đái xuất hiện, nhi thả lưỡng dẫn vật đái đích lượng độ ứng đại thể nhất trí, như nhất điều dẫn vật hữu điều đái, nhất điều dẫn vật vô điều đái, thử thời tố PCR hữu khả năng thất bại, ứng hòaDẫn vật hợp thànhĐan vị hiệp thương giải quyết. Như nhất điều dẫn vật lượng độ cao, nhất điều lượng độ đê, tại hi thích dẫn vật thời yếu bình hành kỳ nùng độ. ③ dẫn vật ứng cao nùng độ tiểu lượng phân trang bảo tồn, phòng chỉ đa thứ đống dung hoặc trường kỳ phóng băng tương lãnh tàng bộ phân, đạo trí dẫn vật biến chất
Hàng giải thất hiệu. ④Dẫn vật thiết kếBất hợp lý, như dẫn vật trường độ bất cú, dẫn vật chi gian hình thànhNhị tụ thểĐẳng.
Mg2+Nùng độ: Mg2+Ly tử nùng độ đối PCR khoách tăng hiệu suất ảnh hưởng ngận đại, nùng độ quá cao khả hàng đê PCR khoách tăng đích đặc dị tính, nùng độ quá đê tắc ảnh hưởng PCR khoách tăng sản lượng thậm chí sử PCR khoách tăng thất bại nhi bất xuất khoách tăng điều đái.
Phản ứng thể tích đích cải biến: Thông thường tiến hành PCR khoách tăng thải dụng đích thể tích vi 20ul, 30ul, 50ul. Hoặc 100ul, ứng dụng đa đại thể tích tiến hành PCR khoách tăng, thị căn cư khoa nghiên hòa lâm sàng kiểm trắc bất đồng mục đích nhi thiết định, tại tố tiểu thể tích như 20ul hậu, tái tố đại thể tích thời, nhất định yếu mô tác điều kiện, phủ tắc dung dịch thất bại.
Vật lý nguyên nhân: Biến tính đối PCR khoách tăng lai thuyết tương đương trọng yếu, như biến tính ôn độ đê, biến tính thời gian đoản, cực hữu khả năng xuất hiện giả âm tính; thối hỏa ôn độ quá đê, khả trí phi đặc dị tính khoách tăng nhi hàng đê đặc dị tính khoách tăng hiệu suất thối hỏa ôn độ quá cao ảnh hưởng dẫn vật dữ mô bản đích kết hợp nhi hàng đê PCR khoách tăng hiệu suất. Hữu thời hoàn hữu tất yếu dụng tiêu chuẩn đích ôn độ kế, kiểm trắc nhất hạ khoách tăng nghi hoặc thủy dung oa nội đích biến tính, thối hỏa hòa diên thân ôn độ, giá dã thị PCR thất bại đích nguyên nhân chi nhất.
Bá tự liệt biến dị: Như bá tự liệt phát sinh đột biến hoặc khuyết thất, ảnh hưởng dẫn vật dữ mô bản đặc dị tính kết hợp, hoặc nhân bá tự liệt mỗ đoạn khuyết thất sử dẫn vật dữ mô bản thất khứ hỗ bổ tự liệt, kỳ PCR khoách tăng thị bất hội thành công đích.[1]
Xuất hiện đích PCR khoách tăng điều đái dữ mục đích bá tự liệt điều đái nhất trí, hữu thời kỳ điều đái canh chỉnh tề, lượng độ canh cao.
Dẫn vật thiết kế bất hợp thích: Tuyển trạch đích khoách tăng tự liệt dữ phi mục đích khoách tăng tự liệt hữu đồng nguyên tính, nhân nhi tại tiến hành PCR khoách tăng thời, khoách tăng xuất đích PCR sản vật vi phi mục đích tính đích tự liệt. Bá tự liệt thái đoản hoặc dẫn vật thái đoản, dung dịch xuất hiện giả dương tính. Nhu trọng tân thiết kế dẫn vật.
Bá tự liệt hoặc khoách tăng sản vật đích giao xoa ô nhiễm: Giá chủng ô nhiễm hữu lưỡng chủng nguyên nhân: Nhất thị chỉnh cá cơ nhân tổ hoặc đại phiến đoạn đích giao xoa ô nhiễm, đạo trí giả dương tính. Giá chủng giả dương tính khả dụng dĩ hạ phương pháp giải quyết: Thao tác thời ứng tiểu tâm khinh nhu, phòng chỉ tương bá tự liệt hấp nhập gia dạng thương nội hoặc tiên xuất ly tâm quản ngoại. Trừ môi cập bất năng nại cao ôn đích vật chất ngoại, sở hữu thí tề hoặc khí tài quân ứng cao áp tiêu độc. Sở dụng ly tâm quản cập dạng tiến thương đầu đẳng quân ứng nhất thứ tính sử dụng. Tất yếu thời, tại gia tiêu bổn tiền, phản ứng quản hòa thí tề dụng tử ngoại tuyến chiếu xạ, dĩ phá phôi tồn tại đích hạch toan. Nhị thị không khí trung đích tiểu phiến đoạn hạch toan ô nhiễm, giá ta tiểu phiến đoạn bỉ bá tự liệt đoản, đãn hữu nhất định đíchĐồng nguyên tính.Khả hỗ tương bính tiếp, dữ dẫn vật hỗ bổ hậu, khả khoách tăng xuất PCR sản vật, nhi đạo trí giả dương tính đích sản sinh, khả dụng sào thức PCR phương pháp lai giảm khinh hoặc tiêu trừ.
Xuất hiện phi đặc dị tính khoách tăng đái:
PCR khoách tăng hậu xuất hiện đích điều đái dữ dự kế đích đại tiểu bất nhất trí, hoặc đại hoặc tiểu, hoặc giả đồng thời xuất hiện đặc dị tính khoách tăng đái dữ phi đặc dị tính khoách tăng đái. Phi đặc dị tính điều đái đích xuất hiện, kỳ nguyên nhân: Nhất thị dẫn vật dữ bá tự liệt bất hoàn toàn hỗ bổ, hoặc dẫn vật tụ hợp hình thànhNhị tụ thể.Nhị thị Mg2+Ly tử nùng độ quá cao,Thối hỏa ôn độQuá đê, cập PCR tuần hoàn thứ sổ quá đa hữu quan. Kỳ thứ thị môi đích chất hòa lượng, vãng vãng nhất ta lai nguyên đích môi dịch xuất hiện phi đặc dị điều đái nhi lánh nhất lai nguyên đích môi tắc bất xuất hiện, môi lượng quá đa hữu thời dã hội xuất hiện phi đặc dị tính khoách tăng. Kỳ đối sách hữu: Tất yếu thời trọng tân thiết kế dẫn vật. Giảm đê môi lượng hoặc điều hoán lánh nhất lai nguyên đích môi. Hàng đê dẫn vật lượng, thích đương tăng gia mô bản lượng, giảm thiếu tuần hoàn thứ sổ. Thích đương đề cao thối hỏa ôn độ hoặc thải dụng nhị ôn độ điểm pháp ( 93℃ biến tính, 65℃ tả hữu thối hỏa dữ diên thân ).
Xuất hiện phiến trạng tha đái hoặc đồ mạt đái:
PCR khoách tăng hữu thời xuất hiện đồ mạt đái hoặc phiến trạng đái hoặc địa thảm dạng đái. Kỳ nguyên nhân vãng vãng do vu môi lượng quá đa hoặc môi đích chất lượng soa, dNTP nùng độ quá cao, Mg2+Nùng độ quá cao, thối hỏa ôn độ quá đê, tuần hoàn thứ sổ quá đa dẫn khởi. Kỳ đối sách hữu: Giảm thiếu môi lượng, hoặc điều hoán lánh nhất lai nguyên đích môi. ② giảm thiếu dNTP đích nùng độ. Thích đương hàng đê Mg2+Nùng độ. Tăng gia mô bản lượng, giảm thiếu tuần hoàn thứ sổ.[3]
Dụng vu trị liệu cảm nhiễm tính tật bệnh, thũng lựu cập di truyện bệnh.[6]
PCR tại y học kiểm nghiệm học trung tối hữu giới trị đích ứng dụng lĩnh vực tựu thị đối cảm nhiễm tính tật bệnh đích chẩn đoạn. Lý luận thượng, chỉ yếu dạng bổn hữu nhất cá bệnh nguyên thể tồn tại, PCR tựu khả dĩ kiểm trắc đáo. Nhất bàn thật nghiệm thất dã năng kiểm xuất 10~100 cơ nhân khảo bối, nhi mục tiền bệnh nguyên thể kháng nguyên kiểm trắc phương pháp nhất bàn nhu yếu 105-7 cá bệnh nguyên thể tài khả kiểm trắc đáo. PCR đối bệnh nguyên thể đích kiểm trắc giải quyết liễu miễn dịch học kiểm trắc đích “Song khẩu kỳ” vấn đề, khả phán đoạn tật bệnh thị phủ xử vu ẩn tính hoặc á lâm sàng trạng thái.
Định lượng PCR nghiên cứu tư liêu dĩ biểu minh, bệnh nguyên thể sổ lượng dữ cảm nhiễm tính tật bệnh bệnh tình đích khinh trọng trình độ, truyện nhiễm tính cập trị liệu hiệu quả quân hữu tương quan tính. Hứa đa nghiên cứu biểu minh, nhân loại miễn dịch khuyết hãm bệnh độc ( HIV ) cảm nhiễm hậu, tiềm phục kỳ trường đoản hòa lâm sàng chứng trạng khinh trọng dữ huyết dịch trung đích bệnh độc lượng hiển trứ tương quan; dã hữu nghiên cứu biểu minh, HIV bệnh độc tái lượng đê vu nhất định trị thời, một hữu truyện nhiễm tính.
Tại ất hình can viêm bệnh độc, bính hình can viêm bệnh độc định lượng nghiên cứu trung phát hiện, bệnh độc đích sổ lượng dữ mỗ ta dược vật đích liệu hiệu tương quan. Lệ như, càn nhiễu tố trị liệu đối can viêm bệnh độc cao khảo bối giả bất mẫn cảm, đê khảo bối giả mẫn cảm; nhi hữu ta dược vật tắc cụ hữu hiển trứ hàng đê bệnh độc cao khảo bối đích tác dụng.[6]
Nham cơ nhân đích biểu đạt tăng gia hòa đột biến, tại hứa đaThũng lựuTảo kỳ hòa lương tính đích giai đoạn tựu khả xuất hiện. PCR kỹ thuật bất đãn năng hữu hiệu đích kiểm trắc cơ nhân đích đột biến, nhi thả năng chuẩn xác kiểm trắc nham cơ nhân đích biểu đạt lượng, khả cư thử tiến hành thũng lựu tảo kỳ chẩn đoạn, phân hình, phân kỳ hòa dự hậu phán đoạn.
Kỉ hồ sở hữu mạn tính cốt tủy tính bạch huyết bệnh hoạn giả đô khả kiểm trắc đáo nguyên nham cơ nhân dịch vị đạo trí đích BCR/ABL dung hợp cơ nhân hình thành, định lượng PCR kỹ thuật khả thông quá kiểm trắc BCR/ABL dung hợp cơ nhân đích biểu đạt xác định vi lượng tàn dư ác tính tế bào tồn tại đích sổ lượng, dĩ thử tác vi trị liệu hiệu quả hòa cổ kế phục phát đích nguy hiểm tính đích y cư.
Nhất taBệnh độcTrí nham tác dụng dã dữ bệnh độc tái lượng hữu quan, EB bệnh độc tái lượng đích FQ-PCR kiểm trắc kết quả dĩ bị dụng vu tị yết nham tảo kỳ phát hiện hòa tùy phóng.[6]
PCR kỹ thuật thủ thứ lâm sàng ứng dụng tựu thị tòng kiểm trắc liêm trạng tế bào hòaβ- địa trung hải bần huyếtĐích cơ nhân đột biến khai thủy đích. Cơ nhân đích đột biến hòa khuyết thất quân hội dẫn khởi các chủng châu đản bạch đích biểu đạt bất bình hành, dụng FQ-PCR kiểm trắc các chủng châu đản bạch cơ nhân biểu đạt soa dị, thịĐịa trung hải bần huyếtChẩn đoạn đích hữu hiệu thủ đoạn.[6]
PCR phản ứng đích tối đại đặc điểm thị cụ hữu giác đại khoách tăng năng lực dữ cực cao đích linh mẫn tính, đãn lệnh nhân đầu thống đích vấn đề thị dịch ô nhiễm, cực kỳ vi lượng đích ô nhiễm tức khả tạo thành giả dương tính đích sản sinh.[6]
1, tiêu bổn gian giao xoa ô nhiễm: Tiêu bổn ô nhiễm chủ yếu hữu thu tập tiêu bổn đích dung khí bị ô nhiễm, hoặc tiêu bổn phóng trí thời, do vu mật phong bất nghiêm dật vu dung khí ngoại, hoặc dung khí ngoại niêm hữu tiêu bổn nhi tạo thành tương hỗ gian giao xoa ô nhiễm; tiêu bổn hạch toan mô bản tại đề thủ quá trình trung, do vu hấp dạng thương ô nhiễm đạo trí tiêu bổn gian ô nhiễm; hữu ta vi sinh vật tiêu bổn vưu kỳ thị bệnh độc khả tùy khí dung giao hoặc hình thành khí dung giao nhi khoách tán, đạo trí bỉ thử gian đích ô nhiễm.
2, PCR thí tề đích ô nhiễm: Chủ yếu thị do vu tại PCR thí tề phối chế quá trình trung, do vu gia dạng thương, dung khí, song chưng thủy cập kỳ tha dung dịch bị PCR hạch toan mô bản ô nhiễm.
3, PCR khoách tăng sản vật ô nhiễm: Giá thị PCR phản ứng trung tối chủ yếu tối thường kiến đích ô nhiễm vấn đề. Nhân vi PCR sản vật khảo bối lượng đại ( nhất bàn vi 1013 khảo bối /ml ), viễn viễn cao vu PCR kiểm trắc sổ cá khảo bối đích cực hạn, sở dĩ cực vi lượng đích PCR sản vật ô nhiễm, tựu khả hình thành giả dương tính. Hoàn hữu nhất chủng dung dịch hốt thị, tối khả năng tạo thành PCR sản vật ô nhiễm đích hình thức thị khí dung giao ô nhiễm. Tại không khí dữ dịch thể diện ma sát thời tựu khả hình thành khí dung giao, tại thao tác thời bỉ giác kịch liệt địa diêu động phản ứng quản, khai cái thời, hấp dạng thời cập ô nhiễm tiến dạng thương đích phản phục hấp dạng đô khả hình thành khí dung giao nhi ô nhiễm. Cư kế toán nhất cá khí dung giao khỏa lạp khả hàm 48000 khảo bối, nhân nhi do kỳ tạo thành đích ô nhiễm thị nhất cá trị đắc đặc biệt trọng thị đích vấn đề.
4, thật nghiệm thất trung khắc long chất lạp đích ô nhiễm: Tại phân tử sinh vật học thật nghiệm thất cập mỗ ta dụng khắc long chất lạp tố dương tính đối chiếu đích kiểm nghiệm thất, giá cá vấn đề dã bỉ giác thường kiến. Nhân vi khắc long chất lạp tại đan vị dung tích nội hàm lượng tương đương cao, lánh ngoại tại thuần hóa quá trình trung nhu dụng giác đa đích dụng cụ cập thí tề, nhi thả tại hoạt tế bào nội đích chất lạp, do vu hoạt tế bào đích sinh trường phồn thực đích giản tiện tính cập cụ hữu ngận cường đích sinh mệnh lực. Kỳ ô nhiễm khả năng tính dã ngận đại.[6]
Nhất cá hảo đích thật nghiệm thất, yếu thời khắc chú ý ô nhiễm đích giam trắc, khảo lự hữu vô ô nhiễm thị thập ma nguyên nhân tạo thành đích ô nhiễm, dĩ tiện thải thủ thố thi, phòng chỉ hòa tiêu trừ ô nhiễm.
1, dương tính đối chiếu: Tại kiến lập PCR phản ứng thật nghiệm thất cập nhất bàn đích kiểm nghiệm đan vị đô ứng thiết hữu PCR dương tính đối chiếu, tha thị PCR phản ứng thị phủ thành công, sản vật điều đái vị trí cập đại tiểu thị phủ hợp hồ lý luận yếu cầu đích nhất cá trọng yếu đích tham khảo tiêu chí. Dương tính đối chiếu yếu tuyển trạch khoách tăng độ trung đẳng, trọng phục tính hảo, kinh các chủng giám định thị cai sản vật đích tiêu bổn, như dĩ trọng tổ chất lạp vi dương tính đối chiếu, kỳ hàm lượng nghi đê bất nghi cao ( 100 cá khảo bối dĩ hạ ). Đãn dương tính đối chiếu vưu kỳ thị trọng tổ chất lạp cập cao nùng độ dương tính tiêu bổn, kỳ đối kiểm trắc hoặc khoách tăng dạng phẩm ô nhiễm đích khả năng tính ngận đại. Nhân nhi đương mỗ nhất PCR thí tề kinh tự kỷ sử dụng ổn định, kiểm nghiệm nhân viên tâm trung hữu sổ thời, tại dĩ hậu đích thật nghiệm trung khả miễn thiết dương tính đối chiếu.
2, âm tính đối chiếu: Mỗi thứ PCR thật nghiệm vụ tất tố âm tính đối chiếu. Tha bao quát:
( 1 ) tiêu bổn đối chiếu: Bị kiểm đích tiêu bổn thị huyết thanh tựu dụng giám định hậu đích chính thường huyết thanh tác đối chiếu; bị kiểm đích tiêu bổn thị tổ chức tế bào tựu dụng tương ứng đích tổ chức tế bào tác đối chiếu.
( 2 ) thí tề đối chiếu: Tại PCR thí tề trung bất gia mô bản DNA hoặc RNA, tiến hành PCR khoách tăng, dĩ giam trắc thí tề thị phủ ô nhiễm.
3, trọng phục tính thí nghiệm.
4, tuyển trạch bất đồng khu vực đích dẫn vật tiến hành PCR khoách tăng.[6]
