Từ đồng nghĩaMôi liên miễn dịch hấp thụ trắc định( môi liên miễn dịch hấp thụ trắc định ) giống nhau chỉ môi liên miễn dịch hấp thụ trắc định pháp
1971 nămThuỵ ĐiểnHọc giả Engvall cùng Perlmann,Hà LanHọc giả Van Weerman cùng Schuurs phân biệt đưa tin đem miễn dịchKỹ thuật phát triểnVì kiểm tra đo lường thể dịch trung vi lượng vật chấtCố tương miễn dịch trắc địnhPhương pháp, tức môi liên miễn dịch hấp thụ trắc định pháp (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA). ELISA đã trở thànhPhân tích hóa họcTrong lĩnh vực tuyến đầu đầu đề, nó là một loại đặc thù thuốc thử phân tích phương pháp, là ởMiễn dịch môi kỹ thuật( immunoenzymatic techniques ) cơ sở thượng phát triển lên một loại kiểu mới miễn dịch trắc định kỹ thuật.
- Tiếng Trung danh
- Môi liên miễn dịch hấp thụ trắc định pháp
- Ngoại văn danh
- Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA
- Đừng danh
- ELISA pháp
- Phát hiện giả
- Van Weerman
- Nguyên lý
- Kháng thểCùngMôi hợp chấtKết hợp hiện sắc
- Làm dùng
- Bảo trì nàyMiễn dịch hoạt tính
Môi liên miễn dịch thực nghiệm tẩy bảnNó trung tâm chính là làm kháng thể cùngMôi hợp chấtKết hợp, sau đó thông qua hiện sắc tới kiểm tra đo lường.
① sửKháng nguyênHoặc kháng thể kết hợp đến nào đó cố tương vật dẫn mặt ngoài, cũng bảo trì nàyMiễn dịch hoạt tính.
② sử kháng nguyên hoặc kháng thể cùng nào đó môi liên tiếp thành môi tiêu kháng nguyên hoặc kháng thể, loại này môi tiêu kháng nguyên hoặc kháng thể đã giữ lại này miễn dịch hoạt tính, lại giữ lại môi hoạt tính. Ở trắc định khi, đem chịu kiểm tiêu bản ( trắc định trong đó kháng thể hoặc kháng nguyên ) cùng môi tiêu kháng nguyên hoặc kháng thể ấn bất đồng bước đi cùng cố tương vật dẫn mặt ngoài kháng nguyên hoặc kháng thể khởi phản ứng. Dùng gột rửa phương pháp sử cố tương vật dẫn thượng hình thànhKháng nguyên kháng thể hợp chấtCùng mặt khác vật chất tách ra, cuối cùng kết hợp ở cố tương vật dẫn thượng môi lượng cùng tiêu bản trung chịu kiểmVật chất lượngThành nhất định tỉ lệ. Gia nhậpMôi phản ứngĐế vật sau, đế vật bịMôi thôi hóaBiến thành có sắc sản vật, sản vật lượng cùng tiêu bản trung chịu kiểm vật chất lượng trực tiếp tương quan, cố nhưng căn cứNhan sắc phản ứngSâu cạn tới tiến hành định tính hoặc phân tích định lượng. Bởi vì môi thôi hóa tần suất rất cao, cố nhưng cực đại mà phóng đại phản ứng hiệu quả, do đó sử trắc định phương pháp đạt tới rất caoMẫn cảm độ.
ELISA nhưng dùng cho trắc định kháng nguyên, cũng có thể dùng cho trắc định kháng thể. Tại đây loại trắc định phương pháp trung có 3 loại tất yếu thuốc thử:
① cố tương kháng nguyên hoặcKháng thể
③ môi tác dụng đế vật (Hiện sắc tề). Căn cứ thuốc thử nơi phát ra cùng tiêu bản tính trạng cùng với kiểm tra đo lường cụ bị điều kiện, nhưng thiết kế ra các loại bất đồng loại hình kiểm tra đo lường phương pháp.
⒈Chính thức thí nghiệmKhi, bổn phận đừng lấyDương tính đối chiếuCùngÂm tính đối chiếuKhống chế thí nghiệm điều kiện, đãi kiểm hàng mẫuỨng làmNhất thức nhị phân, lấy bảo đảm thực nghiệm kết quảChuẩn xác tính.Có khiNềnSo cao, thuyết minh có không những khác phái phản ứng, nhưng chọn dùng dương huyết thanh, thỏ huyết thanh hoặcBSAChờ phong bế.
⒉ ởELISATrung, tiến hành các hạng thực nghiệm điều kiện lựa chọn là rất quan trọng, trong đó bao gồm:
⑴ cố tương vật dẫn lựa chọn: Rất nhiều vật chất nhưng làm cố tương vật dẫn, nhưPolyvinyl chloride,Tụ xti-ren,Tụ Bính tiên án cùngChất xơChờ. Này hình thức có thể là lõm khổng cứng nhắc, ống nghiệm, châu viên chờ. Trước mặt thường dùng chính là 40 khổng tụ xti-ren lõmKhổng bản.Mặc kệ loại nào vật dẫn, ở sử dụng trước đều nhưng tiến hành sàng chọn: Dùng ngang nhau kháng nguyên bao bị, ở cùng thực nghiệm điều kiện hạ tiến hành phản ứng, quan sát nàyHiện sắc phản ứngHay khôngĐều một tính,Dưới đây phân biệt rõ này hấp thụ tính năng hay không tốt đẹp.
⑵ bao bị kháng thể ( hoặc kháng nguyên ) lựa chọn: Đem kháng thể ( hoặc kháng nguyên ) hấp thụ ở cố tương vật dẫn mặt ngoài khi, yêu cầu độ tinh khiết muốn hảo, hấp thụ khi giống nhau yêu cầuPHỞ 9.0～9.6 chi gian. Hấp thụ độ ấm, thời gian và lòng trắng trứng lượng cũng có nhất định ảnh hưởng, giống nhau chọn thêm dùng 4℃, 18～ 24 giờ.ProteinBao bị nhất thích độ dày cần tiến hành chuẩn độ: Tức dùng bất đồng protein độ dày ( 0.1, 1.0 cùng 10μg/ml chờ ) tiến hành bao bị sau, ở cái khác thí nghiệm điều kiện tương đồng khi, quan sát dương tính tiêu bảnOD( optical density-Quang mật độ) giá trị. Lựa chọnOD giá trịLớn nhất mà lòng trắng trứng lượng ít nhất độ dày. Đối với đa số protein tới thuyết phục thường vì 1～10μg/ml.
⑶Môi đánh dấu kháng thểCông tác độ dày lựa chọn: Đầu tiên dùng trực tiếp ELISA pháp tiến hành bước đầuHiệu giớiChuẩn độ ( thấy môi đánh dấu kháng thể bộ phận ). Sau đó lại cố định cái khác điều kiện hoặc áp dụng “Phương trận pháp” ( bao bị vật, đãi kiểm hàng mẫu tham khảo phẩm cập môi đánh dấu kháng thể phân biệt vì bất đồngPha loãng độ) ở chính thức thực nghiệm hệ thống chuẩn xác mà chuẩn độ này công tác độ dày.
⑷ môi đế vật cậpCung hydro thểLựa chọn: Đối cung hydro thể lựa chọn yêu cầu là giới liêm, an toàn, có rõ ràng màHiện sắc phản ứng,Mà bản thân vô sắc. Có chút cung hydro thể ( như OPD chờ ) có tiềm tàngTrí ung thư tác dụng,Ứng chú ý phòng hộ. Có điều kiện giả ứng sử dụng bất trí ung thư, độ nhạy cao cung hydro thể, nhưTMBCùngABTSLà trước mặt tương đối vừa lòng cung hydro thể. Đế vật tác dụng một đoạn thời gian sau, ứng gia nhậpCường toanHoặc chất kiềm lấy ngưng hẳn phản ứng. Thông thường đế vật tác dụng thời gian, lấy 10-30 phút vì nghi. Đế vật sử dụng dịch cần thiết mới mẻ phối chế, đặc biệt là H2O2 ở lâm dùng trước gia nhập.
ELISA dùng huyết thanh tới kiểm tra đo lường, đầu tiên máu phải trải qua ít nhất nửa giờ gắn kết, sau đó lấy huyết thanh. Đem môi hợp chất dùngPha loãng dịchPha loãng sau, thêm huyết thanh cập âm tính, dương tính đối chiếu, còn có chính là chất khống phẩm ( đây là nghiêm khắc yêu cầu, nó phạm vi cần thiết ở chất khống trong phạm vi ). Trải qua một giờ ấp trứng, sau đó tẩy bản, thêm đế vật, nửa giờ ưa tối phản ứng sau thêm ngưng hẳn dịch tức hoàn thành phản ứng bộ phận, sau đó chính là số ghi. Từ trị số tới phán đoán kết quả âm tính hoặc dương tính.
Song kháng thể có nhân phápMột, đemĐặc dị tínhKháng thể cùng cố tương vật dẫn liên tiếp, hình thành cố chống đỡ thể: Gột rửa trừ bỏ chưa kết hợp kháng thể cập tạp chất.
Nhị, thêm chịu kiểm tiêu bản: Sử chi cùng cố chống đỡ thể tiếp xúc phản ứng một đoạn thời gian, làm tiêu bản trung kháng nguyên cùng cố tương vật dẫn thượng kháng thể kết hợp, hình thành cố chống đỡ nguyên hợp chất. Gột rửa trừ bỏ mặt khác chưa kết hợp vật chất.
Tam, thêm môi tiêu kháng thể: Sử cố tươngMiễn dịch hợp chấtThượng kháng nguyên cùng môi tiêu kháng thể kết hợp. Hoàn toàn gột rửa chưa kết hợp môi tiêu kháng thể. Lúc này cố tương vật dẫn thượng có chứa môi lượng cùng tiêu bản trung chịu kiểm vật chất lượngChính tương quan.
Bốn, thêm đế vật: Có nhân thức hợp chất trung môi thôi hóa đế vật trở thành có sắc sản vật. Căn cứ nhan sắc phản ứng trình độ tiến hành nên kháng nguyên định tính hoặc định lượng.
Căn cứ đồng dạng nguyên lý, đemĐại phần tửKháng thể phân biệt chế bị cố chống đỡ nguyên cùng môi tiêu kháng nguyên kết hợp vật, có thể dùng song kháng nguyên có nhân pháp trắc định tiêu bản trung kháng thể.
ỞLâm sàng kiểm nghiệmTrung, này pháp áp dụng với kiểm nghiệm các loại protein chờ đại phần tử kháng nguyên, tỷ nhưHBsAg,HBeAg,AFP,hCGChờ. Chỉ cần đạt được nhằm vào chịu kiểmKháng nguyên khác pháiKháng thể, liền nhưng dùng cho bao bị cố tương vật dẫn cùng chế bị môi kết hợp vật mà thành lập này pháp. Như kháng thể nơi phát ra vìKháng huyết thanh,Bao bị cùng môi tiêu dùng kháng thể tốt nhất phân biệt lấy tự bất đồng loại thuộc động vật. Như ứng dụngĐơn clone kháng thể,Giống nhau lựa chọn hai cái nhằm vào kháng nguyên thượng bất đồngQuyết định thốcĐơn kháng,Phân biệt dùng cho bao bị cố tương vật dẫn cùng chế bị môi kết hợp vật. Loại này song vị điểmCó nhân phápCó rất cao đặc dị tính, hơn nữa có thể đem chịu kiểm tiêu bản cùng môi tiêu kháng thể cùng nhau giữ ấm phản ứng, làm một bước pháp kiểm tra đo lường.
Ở một bước pháp trắc định trung, đương tiêu bản trung chịu kiểm kháng nguyên hàm lượng rất cao khi, quá liều kháng nguyên phân biệt cùng cố chống đỡ thể cập môi tiêu kháng thể kết hợp, mà không hề hình thành "Có nhân hợp chất". Cùng loại vớiLắng đọng lại phản ứngTrungKháng nguyên quá thừaSau mang hiện tượng,Lúc này phản ứng sau hiện sắc hút quang giá trị ( ở vào kháng nguyên quá thừa mang lên ) cùngTiêu chuẩn đường cong( ở vàoKháng thể quá thừa mangThượng ) mỗ một kháng nguyên độ dày hút quang giá trị tương đồng, như ấn thường pháp trắc đọc, đoạt được kết quả đem thấp hơn thực tế hàm lượng, loại này hiện tượng được xưng làCâu trạng hiệu ứng( hook effect ), bởi vì tiêu chuẩn đường cong tới cao phong sau trình câu trạng cong lạc. Câu trạng hiệu ứng nghiêm trọng khi, phản ứng thậm chí nhưng không hiện sắc mà xuất hiện giảÂm tính kết quả.Bởi vậy ở sử dụng một bước pháp thuốc thử trắc định tiêu bản trung hàm lượng nhưng dị thường tăng cao vật chất ( tỷ như huyết thanh trung HBsAg, AFP cùng nước tiểu hCG chờ ) khi, ứng chú ý nhưng trắc phạm vi tối cao giá trị. Dùng cao lực tương tác đơn clone kháng thể chế bị này loại thuốc thử nhưng suy yếu câu trạng hiệu ứng.
Giả sử ở bị trắc phần tử bất đồng vị điểm thượng đựng nhiều tương đồng quyết định thốc, tỷ như HBsAg a quyết định thốc, cũng có thể dùng nhằm vào này quyết định cùng đơn kháng phân biệt bao bị cố tương cùng chế bị môi kết hợp vật. Nhưng ở HBsAg kiểm tra đo lường trung ứng chú ý á hình vấn đề, HBsAg có adr, adw, ayr, ayw4 cái á hình, hiển nhiên mỗi loại á hình đều có tương đồng a quyết định thốcPhản ứng tính,Đây cũng là dùng đơn kháng làm có nhân pháp ứng chú ý vấn đề.
Song kháng thể có nhân pháp trắc kháng nguyên một khác chú ý điểm làLoại phong thấp ước số( RF ) quấy nhiễu. RF là một loạiTự thân kháng thể,Nhiều vì IgM hình, có thể cùng nhiều loại động vật IgG Fc đoạn kết hợp. Dùng làm song kháng thể có nhân pháp kiểm tra đo lườngHuyết thanh tiêu bảnTrung như đựng RF, nó nhưng đảm đương kháng nguyên thành phần, đồng thời cùng cố chống đỡ thể cùng môi tiêu kháng thể kết hợp, biểu hiện raGiả dương tínhPhản ứng. Chọn dùng F ( ab' ) hoặcFab đoạn ngắnLàm môi kết hợp vật thuốc thử, bởi vì đi trừ bỏ Fc đoạn, do đó nhưng tiêu trừ RF quấy nhiễu. Song kháng thể có nhân pháp ELISA thuốc thử hay không chịu RF ảnh hưởng, đã bị liệt vào loại này thuốc thử hạng nhất khảo hạch chỉ tiêu ( tham kiến 6.2 ).
Song kháng thể có nhân pháp áp dụng với trắc định nhị giới hoặc nhị giới trở lên đại phần tử kháng nguyên, nhưng không thích hợp với trắc địnhNửa kháng nguyênCậpTiểu phần tửĐơn giá kháng nguyên, nhân này không thể hình thành hai vị điểm có nhân.
Song kháng nguyên có nhân pháp trắc kháng thể
Phản ứng hình thức cùng song kháng thể có nhân pháp cùng loại. DùngĐặc dị tính kháng nguyênTiến hành bao bị cùng chế bị môi kết hợp vật, lấy kiểm tra đo lường tương ứng kháng thể. Cùng gián tiếp pháp trắc kháng thể bất đồng chỗ vì lấy môi tiêu kháng nguyên thay thế môi tiêu kháng kháng thể. Này pháp trung chịu kiểm tiêu bản không cần pha loãng, nhưng trực tiếp dùng cho trắc định, bởi vậy này mẫn cảm độ tương đối cao hơn gián tiếp pháp.Viêm gan BTiêu chí vậtTrung kháng HBs kiểm tra đo lường thường chọn dùng bổn pháp. Bổn pháp mấu chốt ở chỗ môi tiêu kháng nguyên chế bị, ứng căn cứ kháng nguyên kết cấu bất đồng, tìm kiếm thích hợp đánh dấu phương pháp.
Ở song kháng thể có nhân pháp trắc định kháng nguyên khi, như ứng dụng nhằm vào kháng nguyên phần tử thượng hai cái bất đồngKháng nguyên quyết định thốcĐơn clone kháng thểPhân biệt làm cố chống đỡ thể cùng môi tiêu kháng thể, thì tại trắc định khi có thể làm cho tiêu bản gia nhập cùng môi tiêu kháng thể gia nhập hai bước cũng làm một bước. Loại này song vị điểm một bước chẳng những đơn giản hoá thao tác, ngắn lạiPhản ứng thời gian,Như ứng dụng cao lực tương tác đơn clone kháng thể, trắc định mẫn cảm tính cùng đặc dị tính cũng lộ rõ đề cao. Đơn clone kháng thể ứng dụng sử trắc định kháng nguyên ELISA đề cao đến tân trình độ.
Ở một bước pháp trắc định trung, ứng chú ý câu trạng hiệu ứng ( hookeffect ), cùng loại với lắng đọng lại phản ứng trung kháng nguyên quá thừa sau mang hiện tượng. Đương tiêu bản trung đãi trắc kháng nguyên độ dày tương đương cao khi, quá liều kháng nguyên phân biệt cùng cố chống đỡ thể cập môi tiêu kháng thể kết hợp, mà không hề hình thành có nhân hợp chất, đoạt được kết quả đem thấp hơn thực tế hàm lượng. Câu trạng hiệu ứng nghiêm trọng khi thậm chí nhưng xuất hiện giả âm tính kết quả.
Gián tiếp pháp trắc kháng thể
Gián tiếp pháp⑴ đem đặc dị tính kháng nguyên cùng cố tương vật dẫn liên tiếp, hình thành cố chống đỡ nguyên: Gột rửa trừ bỏ chưa kết hợp kháng nguyên cập tạp chất.
⑵ thêm pha loãng chịu kiểm huyết thanh: Trong đó đặc dị kháng thể cùng kháng nguyên kết hợp, hình thành cố chống đỡ nguyên kháng thể hợp chất. Kinh gột rửa sau, cố tương vật dẫn thượng chỉ để lạiĐặc dị tínhKháng thể. Mặt khác kháng thể cập huyết thanh trung tạp chất bởi vì không thể cùng cố chống đỡ nguyên kết hợp, ở gột rửa trong quá trình bị tẩy đi.
⑶ thêm môi tiêu kháng kháng thể: Cùng cố tương hợp chất trung kháng thể kết hợp, do đó sử nên kháng thể gián tiếp mà đánh dấu thượng môi. Gột rửa sau, cố tương vật dẫn thượng môi lượng liền đại biểu đặc dị tính kháng thể lượng. Tỷ như dục trắc người đối nào đó bệnh tật kháng thể, nhưng dùng môi tiêu dương kháng ngườiIgG kháng thể.
Bổn pháp chủ yếu dùng cho đốiVi khuẩn gây bệnhKháng thể kiểm tra đo lường mà tiến hành bệnh truyền nhiễm chẩn bệnh. Gián tiếp pháp ưu điểm là chỉ cần biến hóaBao bị kháng nguyênLiền nhưng lợi dụng cùng môi tiêu kháng kháng thể thành lập kiểm tra đo lường tương ứng kháng thể phương pháp.
Gián tiếp pháp thành công mấu chốt ở chỗ kháng nguyên độ tinh khiết. Tuy rằng có khi dùng thô đề kháng nguyên bao bị cũng có thể lấy được thực tế hữu hiệu kết quả, nhưng ứng tận khả năng ban cho thuần hóa, lấy đề cao thí nghiệm đặc dị tính. Đặc biệt ứng chú ý trừ bỏ có thể cùng giống nhau khỏe mạnh người huyết thanh phát sinh phản ứng tạp chất, tỷ như lấy E.Coli vì công trình môi trọng tổ kháng nguyên, nếu như trung đựng E.Coli thành phần, rất có thể cùng chịu quá E.Coli người lây nhiễm huyết thanh trung kháng E.Coli kháng thể phát sinh phản ứng. Kháng nguyên trung cũng không thể đựng cùng môi tiêu kháng người Ig phản ứng vật chất, tỷ như đến từ người huyết tương hoặc nhân thể tổ chức kháng nguyên, như không đem trong đó Ig đi trừ, thí nghiệm trung cũng phát sinh giả dương tính phản ứng. Mặt khác như kháng nguyên trung đựng không quan hệ lòng trắng trứng, cũng sẽ nhânCạnh tranh hấp thụMà ảnh hưởng bao bị hiệu quả.
Gián tiếp pháp trung một loại khác quấy nhiễu nhân tố vì bình thường huyết thanh trung sở hàm cao độ dày không những khác phái kháng thể. Người bệnh huyết thanh trung chịu kiểm đặc dị tính IgG chỉ chiếm tổng IgG trung một bộ phận nhỏ. IgGHấp thụ tínhRất mạnh, không những dị IgG nhưng trực tiếp hấp thụ đến cố tương vật dẫn thượng, có khi cũng có thể hấp thụ đến bao bị kháng nguyên mặt ngoài. Bởi vậy ở gián tiếp pháp trung, kháng nguyên bao bị sau giống nhau dùng không quan hệ protein ( tỷ nhưNgưu huyết thanh lòng trắng trứng) lại bao bị một lần, lấy phong bế ( blocking ) cố tương thượng trống không khoảng cách. Mặt khác, ở kiểm tra đo lường trong quá trình tiêu bản cần đi trước pha loãng ( 1:40~1:200 ), để tránh miễn quá cao âm tính nền ảnh hưởng kết quả phán đoán.
Cạnh tranh pháp
Cạnh tranh pháp nhưng dùng cho trắc định kháng nguyên, cũng có thể dùng cho trắc định kháng thể. Lấy trắc định kháng nguyên vì lệ, chịu kiểm kháng nguyên cùng môi tiêuKháng nguyên cạnh tranhCùngCố tươngKháng thể kết hợp, bởi vậy kết hợp với cố tương môi tiêu kháng nguyên lượng cùng chịu kiểm kháng nguyên lượng trìnhPhát triển trái ngược.Thao tác bước đi như sau:
⑴ đem đặc dị kháng thể cùng cố tương vật dẫn liên tiếp, hình thành cố chống đỡ thể. Gột rửa.
⑵ đãi trắc quản trung thêm chịu kiểm tiêu bản cùng nhất định lượng môi tiêu kháng nguyên hỗn hợpDung dịch,Sử chi cùng cố chống đỡ thể phản ứng. Như chịu kiểm tiêu bản trung vô kháng nguyên, tắc môi tiêu kháng nguyên có thể thuận lợi mà cùng cố chống đỡ thể kết hợp. Như chịu kiểm tiêu bản trung đựng kháng nguyên, tắc cùng môi tiêu kháng nguyên lấy đồng dạng cơ hội cùng cố chống đỡ thể kết hợp, cạnh tranh tính mà chiếm đi môi tiêu kháng nguyên cùng cố tương vật dẫn kết hợp cơ hội, sử môi tiêu kháng nguyên cùng cố tương vật dẫn kết hợp lượng giảm bớt. Tham khảo quản trung chỉ thêm môi tiêu kháng nguyên, giữ ấm sau, môi tiêu kháng nguyên cùng cố chống đỡ thể kết hợp có thể đạt tới nhất nguyên vẹn lượng. Gột rửa.
⑶ thêm đế vật hiện sắc: Tham khảo quản trung bởi vì kết hợp môi tiêu kháng nguyên nhiều nhất, cố nhan sắc sâu nhất. Tham khảo quản nhan sắc chiều sâu cùng đãi trắc quản nhan sắc chiều sâu chi kém, đại biểu chịu kiểm tiêu bản kháng nguyên lượng. Đãi trắc quản nhan sắc càng đạm, tỏ vẻ tiêu bản trung kháng nguyên hàm lượng càng nhiều. Tình hình chung, là thông qua phương sóng vôn am-pe pháp, kiểm tra đo lường bồi dưỡng hệ thốngPhong điện lưu,Thông qua phong điện lưu cùngKháng nguyên kháng thểTuyến tính quan hệTới cuối cùng xác định hệ thống cuối cùng kiểm tra đo lường mục tiêu độ dày.
Đương kháng nguyên tài liệu trungQuấy nhiễu vật chấtKhông dễ trừ bỏ, hoặc không dễ được đến cũng đủ thuần hóa kháng nguyên khi, nhưng dùng này pháp kiểm tra đo lườngĐặc dị tínhKháng thể. Này nguyên lý vì tiêu bản trung kháng thể cùng nhất định lượng môi tiêu kháng thể cạnh tranh cùng cố chống đỡ nguyên kết hợp. Tiêu bản trung kháng thể lượng càng nhiều, kết hợp ở cố tương thượng môi tiêu kháng thể càng thiếu, bởi vậy dương tính phản ứng trình sắc thiển với âm tính phản ứng. Như kháng nguyên vì cao độ tinh khiết, nhưng trực tiếp bao bị cố tướng. Như kháng nguyênTrung sẽCó quấy nhiễu vật chất, trực tiếp bao bị không dễ thành công, nhưng chọn dùng bắt được bao bị pháp, tức trước bao bị cùng cố chống đỡ nguyên tương ứng kháng thể, sau đó gia nhập kháng nguyên, hình thành cố chống đỡ nguyên. Gột rửa trừ bỏ kháng nguyên trung tạp chất, sau đó lại thêm tiêu bản cùng môi tiêu kháng thể tiến hành cạnh tranh kết hợp phản ứng. Cạnh tranh pháp trắc kháng thể có bao nhiêu loại hình thức, nhưng đem tiêu bản cùng môi tiêu kháng thể cùng cố tươngKháng nguyên cạnh tranhKết hợp, kháng HBc ELISA giống nhau chọn dùng này pháp. Một loại khác hình thức làm tướng tiêu bản cùng kháng nguyên cùng nhau gia nhập đến cố chống đỡ thể trung tiến hành cạnh tranh kết hợp, gột rửa sau lại gia nhập môi tiêu kháng thể, cùng kết hợp ở cố tương thượng kháng nguyên phản ứng. Kháng HBe kiểm tra đo lường giống nhau chọn dùng này pháp.
Huyết thanh trung nhằm vào nào đóKháng nguyên đặc dị tínhIgMThường cùng đặc dị tính IgG đồng thời tồn tại, người sau sẽ quấy nhiễuIgM kháng thểTrắc định. Bởi vậy trắc định IgM kháng thể đa dụng bắt được pháp, trước đem sở hữu huyết thanh IgM ( bao gồm khác phái IgM cùng không những khác phái IgM ) cố định ở cố tương thượng, ở đi trừ IgG sau lại trắc định đặc dị tính IgM. Thao tác bước đi như sau:
⑴ đem kháng người IgM kháng thể liên tiếp ở cố tương vật dẫn thượng, hình thành cố chống đỡ người IgM. Gột rửa.
⑵ gia nhập pha loãng huyết thanh tiêu bản: Giữ ấm phản ứng sau huyết thanh trung IgM kháng thể bị cố chống đỡ thể bắt được. Gột rửa trừ bỏ mặt khácMiễn dịch cầu lòng trắng trứngCùng huyết thanh trung tạp chất thành phần.
⑶ gia nhập đặc dị tính kháng nguyên thuốc thử: Nó chỉ cùng cố tương thượng đặc dị tính IgM kết hợp. Gột rửa.
⑷ gia nhập nhằm vàoĐặc dị tínhMôi tiêu kháng thể: Sử chi cùng kết hợp ở cố tương thượng kháng nguyên phản ứng kết hợp. Gột rửa.
⑸ thêm đế vật hiện sắc: Như có nhan sắc biểu hiện, tắc tỏ vẻ huyết thanh tiêu bản trung đặc dị tính IgM kháng thể tồn tại, là vì dương tính phản ứng.
Ứng dụng với ELISA
Thân hòa tốLà một loạiĐường lòng trắng trứng,Nhưng từ lòng trắng trứng trung lấy ra. Phân tử lượng 60kD, mỗi cái phần tử từ 4 cáiÁ cơTạo thành, có thể cùng 4 cáiSinh vật tốPhần tử thân mật kết hợp.Vitamin H,Phân tử lượng 244.31, tồn tại với lòng đỏ trứng trung. Dùng hóa học phương pháp chế thành hợp chất diễn sinh, sinh vật tố － gốc OH hổ pháchÁ ánChỉ ( biotin-hydroxysuccinimide, BNHS ) nhưng cùng protein, đường loại cùng môi chờ nhiều loại loại hình lớn nhỏ phần tử hình thànhSinh vật tố hóaSản vật. Thân hòa tố cùng sinh vật tố kết hợp, tuy không thuộcMiễn dịch phản ứng,Nhưng đặc dị tính cường, lực tương tác đại, hai người một khi kết hợp liền cực kỳ ổn định. Bởi vì 1 cái thân hòa tố phần tử có 4 cái sinh vật tố phần tử kết hợp vị trí, có thể liên tiếp càng nhiều sinh vật tố hóa phần tử, hình thành một loại cùng loại tinh cáchHợp lại thể.Bởi vậy đem thân hòa tố cùng sinh vật tố cùng ELISA ngẫu nhiên liên lên, liền nhưng đại đề cao ELISA mẫn cảm độ.
Thân hòa tố － sinh vật tố hệ thống ở ELISA trung ứng dụng có bao nhiêu loại hình thức, nhưng dùng cho gián tiếp bao bị, cũng nhưng dùng cho chung phản ứng phóng đại. Có thể ở cố tương thượng trước dự bao bị thân hòa tố, nguyên dùngHấp thụ phápBao bị cố tương kháng thể hoặc kháng nguyên cùng sinh vật tố kết hợp, thông qua thân hòa tố － sinh vật tố phản ứng mà sử sinh vật tố hóa kháng thể hoặc kháng ở tương hóa. Loại này bao bị pháp không chỉ có nhưng gia tăng hấp thụ kháng thể hoặc kháng nguyên lượng, hơn nữa làm này kết hợp điểm đầy đủ bại lộ. Mặt khác, ở thường quy ELISA trung môi tiêu kháng thể cũng có thể dùng sinh vật tố hóa kháng thể thay thế, sau đó liên tiếp thân hòa tố － môi kết hợp vật, lấy phóng đại phản ứng tín hiệu.
ELISA thuốc thử
Ở lâm sàng kiểm nghiệm trung giống nhau chọn dùng thương phẩm thuốc thử hộp tiến hành trắc định. ELISA trung có ba cái tất yếu thuốc thử:Miễn dịch hấp thụ tề,Kết hợp vậtCùng môi đế vật chờ. Hoàn chỉnh ELISA thuốc thử hộp bao hàm dưới các chất hợp thành:
ELISA thuốc thử⑶ môi đế vật;
⑷Âm tính đối chiếuPhẩm cùng dương tínhĐối chiếu phẩm( định tính trắc định trung ), tham khảoTiêu chuẩn phẩmCùng khống chế huyết thanh ( định lượng trắc định trung );
Dùng choĐánh dấu kháng thểHoặcKháng kháng thểMôi cần có dưới đây đặc tính: Có độ cao hoạt tính cùngMẫn cảm tính;Ở nhiệt độ phòng hạ ổn định; phản ứng sản vật dễ dàng hiện ra; có thể thương phẩm hoá sinh sản. Trước mặt ứng dụng so nhiều cóCay căn peroxy hóa vật môi( HRP ),Kiềm tính axit phosphoric môi,Đường glucose oxy hoá môiChờ, trong đó lấy HRP ứng dụng nhất quảng.
Peroxy hóa vật môiRộng khắp phân bố với thực vật trung,Cay cănTrung hàm lượng tối cao, từ cay căn trung lấy ra xưng cay căn peroxy hóa vật môi ( HRP ), là từ vô sắcMôi lòng trắng trứngCùng thâm màu nâuThiết PorphyriaCấu thành một loạiĐường lòng trắng trứng(Hàm đường lượng18% ), phân tử lượng ước 40 000, ước từ 300 cáiAxit amin tạo thành,Chờ điện điểmVì pH 3-9,Thôi hóa phản ứngNhất thích pH giá trị nhân cung hydro thể bất đồng mà hơi có sai biệt, giống nhau nhiều ở pH 5 tả hữu. Này môi hòa tan thủy cùng 50% bão hòa độ dướiAxít AmoniDung dịch. Môi lòng trắng trứng cùngPhụ cơLớn nhấtQuang phổ hấp thuPhân biệt vì 275nm cùng 403nm.
Môi độ tinh khiết lấy RZ tỏ vẻ: RZ=OD403/OD275
Thuần môi RZ nhiều ở 3.0 trở lên, tối cao vì 3.4. RZ ở 0.6 dưới môi chế phẩm vì thô môi, phi môi lòng trắng trứng ước chiếm 75%, không thể dùng cho đánh dấu. RZ ở 2.5 trở lên giả mới có thể dùng cho đánh dấu. HRP tác dụng đế vật vìPeroxy hóa hydro,Thôi hóaPhản ứng khiCung hydro thể có vài loại: ( 1 )Lân ben-zen nhị án( OPD ), sản vật vì màu cam, hòa tan được tính, mẫn cảm tính cao, lớn nhấtHấp thu giá trịỞ 490nm, nhưng dùng mắt thường quan sát phân biệt, dễ dàng bị nùngH2SO4Ngưng hẳn phản ứng, nhan sắc nhưng ở số giờ nội không thay đổi, là quốc nội ELISA trung nhất thường dùng một loại; ( 2 ) liên đạiHồi hươngÁn ( OD ), sản vật vì quất hoàng sắc, lớn nhất hấp thu giá trị ở 400nm, nhan sắc so ổn định; ( 3 ) 5－ gốc amin axit salicylic ( 5－AS ): Sản vật vì thâm màu nâu, lớn nhất hấp thu giá trị ở 449nm, bộ phận hòa tan, mẫn cảm tính tương đối kém; ( 4 )Lân liên Toluen án(OT) sản vật vì màu lam, lớn nhất hấp thu giá trị ở 630nm, bộ phận hòa tan, không ổn định, không kiên nhẫn toan, nhưng phản ứng mau, nhan sắc rõ ràng.
Hệ từ nhỏ ngưu tràng niêm mạc cùngĐại tràng khuẩn queTrung lấy ra, từ nhiềuCùng công môiTạo thành. Chúng nó đế giống loài loại rất nhiều, thường dùng giả vìTiêu cơ ben-zenAxit phosphoric muối,Giá rẻ không độc tính.Môi giảiSản vật trình màu vàng, hòa tan được, lớn nhất hấp thu giá trị ở 400nm. Môi hoạt tính lấy ở pH10 phản ứng hệ thống trung, 37℃1 phút thuỷ phân 1μgAxit phosphoric ben-zen nhị NatriVì một cái đơn vị.
Môi cùng kháng thể giao liên, thường dùngMậu nhị andehitPháp cùng quá iốt toan muối oxy hoá pháp. Quách xuân tường thành lập HRP đánh dấu kháng thể cải tiến quá iốt toan Natri pháp đơn giản dễ hành, đánh dấu hiệu quả hảo, đặc biệt áp dụng với phòng thí nghiệm tiểu phê lượng chế bị. Này đánh dấu trình tự vì: Đem 5μg HRP hòa tan 0.5ml nước cất trung, gia nhập mới mẻ phối chế 0.06mol/LQuá iốt toan Natri (NaIO4) thủy dung dịch 0.5ml,Hỗn đềuTrí 4℃ tủ lạnh 30 phút, lấy ra gia nhập 0.16mol/LGlycolThủy dung dịch 0.5ml, nhiệt độ phòng đặt 30 phút sau gia nhập hàm 5(gThuần hóa kháng thểThủy dung dịch 1ml, hỗn đều cũng trangThẩm táchTúi, lấy 0.05mol/L, pH9.5 than toan muối giảm xóc dịch với 4℃ tủ lạnh trung chậm rãi quấy thẩm tách 6 giờ ( hoặc qua đêm ) sử chi kết hợp, sau đóHút ra,ThêmBoron hydro hóa Natri( NaBH4 ) dung dịch ( 5(g/ml)0.2ml, trí 4℃ tủ lạnh 2 giờ, đem kể trên kết hợp vậtHỗn hợp dịchGia nhập chờ thể tích bão hòa axít Amoni dung dịch, trí 4℃ tủ lạnh 30 phút sau ly tâm, đem đoạt đượcLắng đọng lại vậtHòa tan một chút 0.02mol/L, pH7.4PBS trung, cũng đối chi thẩm tách qua đêm ( 4℃ ), ngày kế ly tâm trừ bỏ không dung vật, tức được đến môi tiêu kháng thể, dùng 0.02mol/L, pH7.4PBS hi đến 5ml, tiến hành trắc định sau,Đông lạnh khô ráoHoặcNhiệt độ thấp bảo tồn.
Môi tiêu kháng thể đánh dấu hiệu quả trắc định: Trắc định nội dung bao gồm môi cùngKháng thể hoạt tính,Kết hợp vậtTrung môi hàm lượng cùngIgGHàm lượng, môi cùng IgGMooreSo giá trị cùng với kết hợp suất.
