Western blot
Western blot,ponekad zvani i kaoproteinski imunoblotiliwestern blotiranje,je široko upotrebljavanaanalitička tehnikaumolekulskoj biologijiiimunogeneticiza otkrivanje specifičnihproteinau uzorku homogenata ili ekstraktatkiva.
Da bi postigla razdvajanje određenog proteina od kompleksa, western blot tehnika koristi tri elementa: razdvajanje po veličini, prijenos proteina na čvrsti nosač i obilježavanje ciljnog proteina pomoću primarnog i sekundarnogantitijela,za vizualizaciju. Stvara sesintetskoiliživotinjskoantitijelo(poznato kaoprimarno antitijelo) koje prepoznaje i veže se za određenu metu proteina. Membrana zaelektroforezuse opere u rastvoru koji sadrži primarno antitijelo, prije nego što se ispere višak antitijela. Dodaje se sekundarno antitijelo koje prepoznaje i veže se za primarno antitijelo. Sekundarno antitelo se vizualizira različitim metodima, kao što subojenje,imunofluorescencijairadioaktivnost,omogućavajući indirektno otkrivanje specifičnog ciljnog proteina.
Ostale srodne tehnike uključujudot blotanalizu,kvantitativni tačkasti blot,imunohistohemijskeiimunocitohemijskepostupke, gdje se antitijela koriste za otkrivanje proteina u tkivima i ćelijama ienzimski imunski test(ELISA).
Naziv 'western blot' igra je na u poređenju saSouthern blot,tehnikom za otkrivanjeDNKkoja je nazvana po svom pronalazaču, engleskom biologuEdwinu Southernu.Slično tome, otkrivanjeRNKnaziva seNorthern blot.[2]Termin "vestern blot" dao je W. Neal Burnette 1981. godine,[3]iako je sam metod nastao 1979. u laboratoriji Harryja Towbina naInstitutu Friedrich MiescheruBaselu,Švicarska.[4]Između 1979. i 2019, spomenut je u naslovima, sažecima i ključnim riječima u više od 400 000PubMedpopisanih publikacija i još uvijek može biti najčešće korištena proteinsko-analitička tehnika.[5]
Primjena
[uredi|uredi izvor]Western blot se opsežno koristi ubiohemijiza kvalitativno otkrivanje pojedinačnih proteina i njihovih modifikacija (kao što suposttranslacijske modifikacije). Procjenjuje se da najmanje 8-9% svih publikacija povezanih s proteinima primjenjuje Western blot.[5]Koristi se kao opći metod za identificiranje prisustva specifičnog pojedinačnog proteina u složenoj mješavini proteina. Polukvantitativna procjena proteina može se izvesti iz veličine i intenziteta boje proteinske trake na blot membrani. Pored toga, primjenaserija razrjeđenjapročišćenog proteina poznatih koncentracija, može se koristiti da bi se omogućila preciznija procjena koncentracije proteina. Western blot se rutinski koristi za verifikacijuproizvodnje proteinanakonkloniranja.Također se koristi u medicinskoj dijagnostici, npr. uHIV-testuiliBSE.
PotvrđujućiHIVtest koristi Western blot za otkrivanje antitijela na HIV u uzorkuseruma.Proteini iz poznatihHIV-zaraženih ćelija odvajaju se i upijaju na membranu kao što je gore opisano. Zatim se serum koji se testira nanosi u koraku primarne inkubacije antitijela; slobodno antitijelo se ispere, a doda se sekundarno anti-ljudsko antitijelo povezano sa enzimskim signalom. Obojene trake tada ukazuju na proteine na koje pacijentov serum sadrži antitijela.[6]
Western blot se takođe koristi kao konačni test za varijantnuCreutzfeldt-Jakobove bolesti,tipaprionskebolesti povezane sa konzumacijom kontaminirane govedine od goveda sagoveđom spongiformnom encefalopatijom(BSE, obično se naziva i 'bolest ludih krava').[7]
Ostala područja primjene su u dijagnozitularemije.Procjena sposobnosti Western blot-a da detektira antitijela protivF. tularensisotkrila je da je njegova osjetljivost gotovo 100%, a specifičnost 99,6%.[8]
Neki oblici testiranja nalajmsku bolestkoriste Western bloting.[9]A western blot can also be used as a confirmatory test for Hepatitis B infection and HSV-2 (Herpes Type 2) infection.[10][11]U veterinarskoj medicini se Western blot ponekad koristi za potvrđivanjeFIV+ statusa kod mačaka.[12]
Daljnja primjena Western blot tehnike uključuju upotrebu Svjetske antidoping agencije(WADA).Doping krvije zloupotreba određenih tehnika i / ili supstanci za povećanje nečije masecrvenih krvnih zrnaca,što omogućava tijelu da transportuje više kisika umišićei time povećava izdržljivost i performanse. Postoje tri široko poznate supstance ili metode koje se koriste za doping krvi, a to sueritropoetin(EPO), sintetski nosači kisika itransfuzija krvi.Svaka je zabranjena WADA-inom listom zabranjenih supstanci i metoda. Western blot tehnika korištena je tokomFIFA-inog svjetskog kupa 2014. u antidoping kampanji za taj događaj.[13]Ukupno je preko Reichela i saradnika[14]sakupljeno i analizirano preko 1.000 uzoraka u WADA akreditovanoj laboratoriji uLozani,Švicarska. Nedavna istraživanja koja koriste Western blot tehniku pokazala su poboljšanu detekciju EPO u krvi i urinu na osnovu novih Velum SAR sklopnih horizontalnih gelova, optimizovanih za rutinsku analizu.[15]Usvajanjem horizontalne SAR-PAGE u kombinaciji sa Velum SAR gelovima koji su podržani od gotovog filma, diskriminacijski kapacitet primjene mikro-doze rEPO je značajno pojačan.
Također pogledajte
[uredi|uredi izvor]References
[uredi|uredi izvor]- ^Yang, Ping-Chang; Mahmood, Tahrin (2012)."Western blot: Technique, theory, and trouble shooting".North American Journal of Medical Sciences.4(9): 429.doi:10.4103/1947-2714.100998.ISSN1947-2714.PMC3456489.
- ^Alwine J, Kemp D, Stark G (1977)."Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes".Proceedings of the National Academy of Sciences USA.74(12): 5350–5354.Bibcode:1977PNAS...74.5350A.doi:10.1073/pnas.74.12.5350.PMC431715.PMID414220.
- ^Burnette WN. (1981). "'Western blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate—polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A ".Analytical Biochemistry.112(2): 195–203.doi:10.1016/0003-2697(81)90281-5.ISSN0003-2697.PMID6266278.
- ^Towbin H, Staehelin T, Gordon J (1979)."Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications".Proceedings of the National Academy of Sciences USA.76(9): 4350–54.Bibcode:1979PNAS...76.4350T.doi:10.1073/pnas.76.9.4350.PMC411572.PMID388439.
- ^abMoritz CP (2020)."40 years Western blotting: A scientific birthday toast".Journal of Proteomics.212:103575.doi:10.1016/j.jprot.2019.103575.PMID31706026.
- ^Sudha, T; Lakshmi, S; Teja, VD (2006)."Western blot profile in HIV infection".Indian Journal of Dermatology, Venereology and Leprology.72(5).doi:10.4103/0378-6323.27752.PMID17050930.Pristupljeno 6. 12. 2020.
- ^Ingrosso, Loredana; Vetrugno, Vito; Cardone, Franco; Pocchiari, Maurizio (1. 6. 2002). "Molecular diagnostics of transmissible spongiform encephalopathies".Trends in Molecular Medicine.8(6): 273–280.doi:10.1016/S1471-4914(02)02358-4.PMID12067613.
- ^SCHMITT, P.; SPLETTSTÖSSER, W.; PORSCH-ÖZCÜRÜMEZ, M.; FINKE, E.-J.; GRUNOW, R. (16. 2. 2005)."A novel screening ELISA and a confirmatory Western blot useful for diagnosis and epidemiological studies of tularemia".Epidemiology and Infection.133(4): 759–766.doi:10.1017/s0950268805003742.ISSN0950-2688.PMC2870305.PMID16050523.
- ^Artsob, Harvey (1993)."Western Blot as a confirmatory test for Lyme disease".The Canadian Journal of Infectious Diseases.4(2): 115–116.doi:10.1155/1993/796390.PMC3250769.PMID22346434.
- ^Castro, L De; Yoshida, C F; Gasper, A M; Gomes, S A (decembar 1996)."Western blot analysis of the reactivity between envelope proteins of hepatitis B viruses from Brazilian carriers and antibodies raised against recombinant hepatitis B vaccines".Acta Virol.40(5–6).PMID9171452.Pristupljeno 6. 12. 2020.
- ^Golden, Matthew; Ashley-Morrow, Rhoda; Swenson, Paul; Hogrefe, Wayne R; Handsfield, H Hunter; Wald, Anna (decembar 2005)."Herpes simplex virus type 2 (HSV-2) Western blot confirmatory testing among men testing positive for HSV-2 using the focus enzyme-linked immunosorbent assay in a sexually transmitted disease clinic".Sexually Transmitted Disease.32(12).doi:10.1097/01.olq.0000175377.88358.f3.Pristupljeno 6. 12. 2020.
- ^"FIV testing – which to use".Catwork.Pristupljeno 6. 12. 2020.
- ^Baume, Norbert; Jan, Nicolas; Emery, Caroline; Mandanis, Béatrice; Schweizer, Carine; Giraud, Sylvain; Leuenberger, Nicolas; Marclay, François; Nicoli, Raul; Perrenoud, Laurent; Robinson, Neil; Dvorak, Jiri; Saugy, Martial (2015)."Antidoping programme and biological monitoring before and during the 2014 FIFA World Cup Brazil".British Journal of Sports Medicine.49(9): 614–622.doi:10.1136/bjsports-2015-094762.ISSN0306-3674.PMC4413745.PMID25878079.
- ^Reichel C, Benetka W, Lorenc B, Thevis M (2016). "Evaluation of AMGEN clone 9G8A anti-Epo antibody for application in doping control".Drug Test Anal.8(11–12): 1131–1137.doi:10.1002/dta.2057.PMID27552163.
- ^https://precisionbiosystems /wp-content/uploads/2016/10/Application_Note_Improvements-for-EPO-detection_Schwenke_2015.pdf
Vanjski linkovi
[uredi|uredi izvor]
| Bibliotečki resursiabout Western immunoblotting |
- Yang, Ping-Chang; Mahmood, Tahrin (2012)."Western blot: Technique, theory, and trouble shooting".North American Journal of Medical Sciences.4(9): 429.doi:10.4103/1947-2714.100998.ISSN1947-2714.PMC3456489.PMID23050259.
- "Western Blotting".YouTube.Bio-Rad Laboratories. 16. 10. 2012.
- "Blotting Techniques/ The Principle of Western Blotting".YouTube.Biomedical and Biological Sciences. 23. 3. 2017.
