Spleißen (Biologie)

AlsSpleißenbzw.Splicing(englischsplice‚miteinander verbinden‘, ‚zusammenkleben‘) wird ein wichtiger Schritt der Weiterverarbeitung (Prozessierung) derRibonukleinsäure(RNA) bezeichnet, der imZellkernvonEukaryotenstattfindet und bei dem aus derprä-mRNAdie reifemRNAentsteht.

Übersicht über die Prozesse dereukaryotischenGenexpression: Auf dem Weg vomGen– codiert auf der DNA – bis hin zum fertigen Protein spielt dieRNAeine entscheidende Rolle. Sie dient als Informationsträger zwischen DNA undRibosom,der in mehreren Schritten verändert wird

Schematische Darstellung des Splicing.

Schematische Darstellung für alternatives Splicing.

Die zunächst in derTranskriptiongebildete prä-mRNA enthält nochIntronsundExons.Durch das Splicing werden die Introns entfernt und die angrenzenden Exons miteinander zur fertigen mRNA verknüpft.

BeimCappingdes 5'-Endes, sowie Splicing undPolyadenylierung(Tailing) des 3'-Endes handelt es sich um einen cotranskriptionalen Vorgang.

Geschichte der Entdeckung

Frühe genetische Untersuchungen konnten zeigen, dassGen,mRNA und Protein colinear sind, was durch die direkte Abschrift bzw. Übersetzung naheliegend war. Sehr gut ist dies inprokaryotischenOrganismen zu beobachten, wo Transkription und Translation nicht durch eine Kompartimentierung der Zelle voneinander getrennt sind. Noch während die RNA-Polymerase die mRNA an der DNA synthetisiert, können bereitsRibosomendienaszierendeKette binden und mit der Translation beginnen, wodurch es zur Ausbildung sogenannterPolysomenkommt.

InEukaryotenist eine Kopplung von Transkription und Translation aber nicht möglich, da eine Kernmembran die beiden Prozesse räumlich voneinander trennt.

Darüber hinaus konnten Chow et al.und Berget et al.in sehr anschaulichen elektronenmikroskopischen Untersuchungen von RNA:DNA-Hybriden am Beispiel vonAdenovirenzeigen, dass die mRNA in Eukaryoten offenbar einer zusätzlichen Prozessierung unterliegen muss, da ihr interne Bereiche fehlen, die aber in der DNA vorkommen. Indirekt konnte eine Reifung anhand der im Vergleich zu zytoplasmatischen RNAs kurzen Halbwertszeit von primären Transkripten, den sogenannten heterogenen nukleären RNAs (hnRNAs) gezeigt werden.

Richard John RobertsundPhillip A. Sharpentwickelten auf dieser Basis das Konzept dersplit genesund des prä-mRNA-Spleißens, das 1993 mit dem Nobelpreis für Medizin belohnt wurde.Grundlegend neu dabei war, dass der Bereich eines eukaryotischen Gens auf der DNA immer wieder von Sequenzen unterbrochen wird, die nicht in Aminosäuren des späteren Proteins translatiert werden. Diese sogenanntenintervening sequences,auch alsIntronsbezeichnet, werden in einem als prä-mRNA-Spleißen bezeichneten Prozess aus dem Primärtranskript, der prä-mRNA (precursor-mRNA), ausgeschnitten unddegradiert.Dabei werden gleichzeitig die beiden angrenzenden proteincodierenden Sequenzabschnitte, oder kurzExonsfür expressed sequences, miteinander verknüpft.

Ein Gen kann dabei bis zu über 60 Introns mit Längen zwischen 35 und 100.000 Nukleotiden enthalten. Darüber hinaus tritt das Splicing nicht nur bei den genannten Eukaryoten auf, sondern auch inMitochondrien,Archaeaund einigen der bereits erwähnten viralen RNAs.

Autokatalytisches Spleißen (self-splicing)

Einige RNAs können Introns ohne die Hilfe eines großenSpliceosoms(siehe unten) entfernen. Die chemischeAktivitätdazu besitzen sie selbst, d. h., es handelt sich umRibozyme,die nur in einigen Fällen (Gruppe II Introns) die Hilfe von Proteinen für eine korrekte Faltung benötigen.

1981 konnten T. Cech et al. für den Vorläufer der26S rRNAvonTetrahymena thermophilanachweisen, dass für die Prozessierung eines etwa 400NukleotidelangenIntronskeine Proteinkomponenten benötigt werden, sondern dass die Aktivität von derRNAselber herrührt. Man spricht daher auch vom autokatalytischen Splicing oderself-splicing.Für diese Entdeckung eines erstenRibozymsund damit der katalytischen Aktivität von RNA, was zur Postulierung einerRNA-Weltin der sehr frühen Phase der Entstehung des Lebens führte, wurdeThomas R. Cechzusammen mitSidney Altman1989 mit demNobelpreisfür Chemie ausgezeichnet. Spätere Untersuchungen konnten zeigen, dass Self-splicing-Intronsin vielen weiteren Organismen auftreten. Entsprechend der Reaktionsmechanismen und der konservierten Sequenzelemente der RNAs können zwei Arten des self-splicings unterschieden werden, die sogenannten Gruppe-I und Gruppe-II-Introns. Auch wenn schlüssig gezeigt werden konnte, dass die RNA die katalytische Aktivität besitzt, scheinenin vivoan den Reaktionen beider Gruppen von Introns zusätzlichProteinebeteiligt zu sein, die wahrscheinlich das Ausbilden der aktiven Struktur der RNA fördern. Da bei den im Folgenden geschilderten Reaktionen die Gesamtzahl derPhosphodiesterbindungenstets gleich bleibt, weil es sich umUmesterungenhandelt, sind keine energielieferndenCofaktorennotwendig.

Gruppe-I-Intronstreten in derprä-rRNAeinfacher Eukaryoten, wie z. B. dem bereits erwähntenCiliatenT. thermophila,sowie in einigen prä-mRNAs vonZellorganellenwieMitochondrienundChloroplastenauf. DieExzisiondes Introns findet in einem Zweischrittmechanismus statt, wobei ein als Cofaktor für die Reaktion essentiellesGuanosin,das durch die Struktur der RNA in die geeignete Position gebracht wird, zunächst einennucleophilen Angriffauf die 5’-splice-sitedurchführt. DienucleofugeGruppe dieser Reaktion, die 3’-Hydroxygruppe des 5’ gelegenen Exons, greift nun seinerseits als Nucleophil die 3’-splice-site an, wodurch die beiden Exons unter Freisetzung des Introns miteinander verknüpft werden. In darauf folgenden Reaktionen schließt sich das Intron schließlich zu einem Ring.StereochemischeUntersuchungen anchiralenSubstraten lassen vermuten, dass hier ein einzigeskatalytisches Zentrumbeide Teilreaktionen des Splicings in Form einerHin- und Rückreaktionkatalysiert.

Gruppe-II-Intronsfinden sich dagegen in prä-mRNAs der Mitochondrien vonHefenund anderenPilzenund in manchen RNA-Vorläufern der Chloroplasten mancher einzelliger Eukaryoten wieChlamydomonas.Ein Guanosin-Cofaktor ist hier nicht notwendig, vielmehr wird durch die Struktur der RNA ein 7 oder 8 Nukleotideupstreamder 3’ splice-site gelegenesAdenosinin die Lage versetzt die 5’ splice-site nucleophil mit seiner 2’ Hydroxy-Gruppe angreifen zu können. Dies führt zur Knüpfung einer ungewöhnlichen 2’ 5’ Phosphodiesterbindung und damit zur Ausbildung einer lassoartigen Struktur des Introns, dem sogenanntenLariat.In einer zweiten Reaktion, ähnlich der der Gruppe-I-Introns, greift schließlich die 5’-splice-site die 3’ splice-site nucleophil an, was zur Verknüpfung beider Exons und dem Freisetzen des Introns führt.

Beim spliceosomalen Prozessieren von mRNAs (siehe unten) findet sich ein dem der Gruppe-II-Introns identischer Reaktionsmechanismus, was zu einer Reihe von Spekulationen geführt hat, ob beide Prozesse evolutionär auseinander hervorgegangen sind (siehe unten bei der „Intron-early “-Hypothese), beispielsweise durch Fragmentierung eines Gruppe-II-Introns, oder ob es sich um konvergente Entwicklungen bedingt durch die katalytische Optimierung der gleichen chemischen Reaktion handelt.

Analog zum Spleißen von RNA ist dasProteinspleißendefiniert.

Splicen von tRNAs

Das enzymatische Splicing vontRNAsfindet sich sowohl beiArchaeaals auch beiEukaryoten,inBakteriendagegen werden Introns in tRNAs nach einem autokatalytischen Mechanismus prozessiert, der im vorangegangenen Abschnitt beschrieben wurde. Die Introns in den für die tRNAs codierenden Genen finden sich meist in der Anticodonschleife direkt 3’ des Anticodons – seltener in der Dihydrouracilschleife – und besitzen eine Länge von 14 bis 60 Basen. Beim enzymatischen Splicing werden sie im Gegensatz zum Splicing von prä-mRNAs nicht über ihre Sequenz, sondern über eine übergeordnete Struktur des Gesamtmoleküls erkannt (beispielsweise das bulge-helix-bulge-motif – BHB-motif – bei Archaea) und in drei Schritten entfernt. Dabei wird die prä-tRNA zunächst zweimal durch eineEndonukleasegeschnitten, die das Intron und zwei sogenannte tRNA-Halbmoleküle freisetzt. Das dabei entstehende zyklische 2’ 3’ Phosphat des 5’ Halbmoleküls wird anschließend zu einem 2’ Phosphat und einer 3’ OH-Gruppe hydrolysiert, während die 5’ OH Gruppe des 3’ Halbmoleküls unterGTP-Verbrauch phosphoryliert wird. Dies ermöglicht eine Ligation durch eine RNA-Ligaseunter ATP-Hydrolyse. Schließlich wird im letzten Schritt das 2’ Phosphat entfernt, was ungewöhnlicherweise unterNAD-Verbrauch und Freisetzung von Nicotinamid vonstattengeht. Auch einige mRNAs werden nach einem ähnlichen, für sie eigentlich sehr untypischen Mechanismus aus zwei endonukleolytischen Spaltungen mit anschließender Ligation durch eine tRNA-Ligase prozessiert.

Splicing im Spliceosom

Das Splicen findet in den meisten Fällen in einem großen Komplex aus RNA und Proteinen statt, dem sogenanntenSpliceosom,welches die Reaktion in zwei aufeinanderfolgendenUmesterungenkatalysiert. Die Mehrzahl der Introns wird auf diese Art und Weise entfernt. Die Anzahl der Bindungen bleibt bei der Reaktion insgesamt gleich, Energie wird nur für den Aufbau und die Umlagerung der Maschinerie für die Katalyse (Spliceosom) benötigt. Die beiden Einzelreaktionen unterscheiden sich chemisch nicht voneinander, lediglich die Positionen der beteiligten Gruppen in der prä-mRNA sind unterschiedlich. Bei beiden Reaktionen findet einenukleophile Substitution(S_N2) an einemPhosphatstatt, dasNukleophilist jeweils eine Hydroxygruppe einerRibose.

Im ersten Schritt greift das Sauerstoffatom der 2'-OH-Gruppe einesAdenosinsaus der sogenannten „branch point sequence “(BPS) ein Phosphoratom einerPhosphodiesterbindungin der 5'-splice site an. Dies führt zur Freisetzung des 5'-Exonsund zur Zirkularisierung desIntrons(aufgrund der lassoartigen Struktur „Lariat “genannt). Im zweiten Schritt greift nun der Sauerstoff der frei gewordenen 3'-OH-Gruppe des 5'-Exons die 3'-splice site an, was zur Verknüpfung der beiden Exons und zur Freisetzung des Intron-Lariats führt.

Das Splicing-Muster kann sich aufgrund der Gewebeart und unter Umwelteinflüssen unterscheiden. Man spricht vonalternativem Splicing,einer wichtigen Grundlage für eine große Diversität von Proteinen. Das Splicing findet cotranskriptionell statt, was bedeutet, dass Introns bereits entfernt werden, noch während diePolymerasedas Gen abliest.

Weitere wichtige Prozesse, die während der Reifung einer prä-mRNA zur mRNA auftreten, sind das

• Capping:Modifikation des 5'-Endes der RNA mit einem7-Methylguanosinfür eine bessere Stabilität der RNA und wichtig für dieTranslationamRibosom.
• Tailing:Nach Erreichen des Genendes wird die RNA circa 15 Nukleotide nach einer speziellenBasensequenz(AAUAAA) geschnitten und mit einem ca. 150–200 Nukleotide langenPoly-A-Schwanzversehen. Auch hier spielt eine Vielzahl von Proteinen eine Rolle (CPSF-Komplex, Cstf-Komplex, CFI, CFII, PABP2, PAP etc.), die neben der erwähnten A2UA3-Sequenz weitere Elemente der RNA binden und das Prozessieren regulieren. Eine Termination der Transkription – ein leider nur sehr wenig verstandener Prozess in Eukaryoten – erfolgt wenig späterdownstreamder Polyadenylierungs-Stelle u. a. durch den TREX-Komplex.

Schließlich wird die reife mRNA durch dieKernporen(nuclear pore complex, NPC) aus demZellkernin dasZytosolexportiert, wo sie anschließend im Verlauf derTranslationdazu genutzt, wirdProteinezu synthetisieren.

Splicing und Krankheiten

Auch bei einigen Krankheitsbildern spielt das Splicing eine große Rolle.MutationeninIntronshaben keinen direkten Effekt auf die Sequenz des Proteins, das durch ein Gen codiert wird. In einigen Fällen jedoch betreffen Mutationen Sequenzen, die für das Splicing wichtig sind und führen so zu einem falschen Prozessieren der prä-mRNA. Die so entstehenden RNAs codieren für unfunktionelle oder sogar schädliche Proteine und führen damit zuerblichen Erkrankungen.

Ein klassisches Beispiel sind einige Formen der β-Thalassämie,einer erblichenHämoglobinopathie,bei denen eine Punktmutation die 5' splice-site vonIntron1 des HBB-Gensverändert und somit unbrauchbar macht. Dies führt dazu, dass nahegelegene „kryptische “splice-sites erkannt werden und dasSpliceosomverkürzte oder verlängerte mRNAs erzeugt, die in inaktive Proteinetranslatiertwerden. Eine weitere gut untersuchte Mutation in Intron 2 des gleichen Gens führt zum Beibehalten einer kurzen Intron-Sequenz in der fertigen mRNA. In beiden Fällen kommt es zu einer stark reduziertenHämoglobinsynthesedes Allels in denerythrozytärenVorstufen. Sind beide Allele von einer solchen Mutation betroffen, entsteht das Krankheitsbild einerβ-Thalassämia major,was u. a. zu einer deutlichen Blutarmut und einem ständigenTransfusionsbedarfführt.

Weitere Fälle sind z. B. dasEhlers-Danlos-Syndrom(EDS) Typ II (Mutation eines branch-points im GenCOL5A1) und diespinale Muskelatrophie(Mutation eines Splicing-Enhancers/Silencers im GenSMN1).

Die „RNA-Fabrik “(RNA-factory)

In den letzten Jahren zeigte sich immer deutlicher, dassTranskription,Prozessierung der RNA (also Splicing,CappingundTailing), RNA-Export in dasZytoplasma,RNA-Lokalisierung,Translationund RNA-Abbau einander beeinflussen und regulieren. Das Prozessieren der prä-mRNA findet noch während der Transkription statt – man spricht vom cotranskriptionellen RNA-Prozessieren – und die unterschiedlichen Maschinerien nehmen dabei miteinander Kontakt auf. Aus diesem Grund wurde kürzlich der Begriff „RNA-Fabrik “(RNA-factory) geprägt, der dies veranschaulichen soll. Das Splicing kann darüber hinaus selbst auf die Prozesse Einfluss nehmen, die räumlich getrennt im Zytoplasma stattfinden. Ein Proteinkomplex, der durch dasSpliceosomauf der fertigen mRNA abgesetzt wird (der Exon-Junction-Complex, EJC), ermöglicht einen effektiven Export aus demZellkernund übermittelt dabei zusätzlich eine Information, die eine spätere Qualitätskontrolle der RNA während der Translation ermöglicht (Nonsense-mediated mRNA decay,[NMD]). Eine weitere Implikation, die sich daraus ergibt, ist: eine vollständige prä-mRNA (wie sie in der Abbildung oben dargestellt ist) kommt in der lebenden Zelle eigentlich nicht vor, denn Introns werden wie eben geschildert während der Transkription entfernt.

Splicing und Evolution

Viele Exons kodieren einen funktionellen Teil eines Proteins, der autonom faltet, eine sogenannte Domäne. Dies ist die Grundlage für die Theorie, dass ein modularer Aufbau eines Gens aus Exons, die solche Proteindomänen codieren, die Möglichkeit mit sich bringt, eine einmal evolutionär „erfundene “Domäne durch Kombination mit anderen vielseitig einzusetzen. So kann durch einfache Rekombination von Exons nach einem Baukastenprinzip eine große Proteinvielfalt mit unterschiedlichsten Funktionen und Eigenschaften geschaffen werden, was alsexon-shufflingbezeichnet wird. Ein klassisches Beispiel dafür ist das Gen für das Protein Fibronectin, das zum einen bei der Zelladhäsion, zum anderen aber auch bei Zellmigration, -proliferationund -differenzierung eine Rolle spielt. Das Protein besteht vorwiegend aus Wiederholungen dreier Proteindomänen, die darüber hinaus auch im Plasminogen-Aktivatorprotein (Typ I), in Proteinen der Blutgerinnung (Typ II), Zelloberflächenrezeptoren und Proteinen der extrazellulären Matrix (Typ III) gefunden werden können.

Darüber hinaus gibt es Vermutungen, dass Introns schon im letzten gemeinsamen, universellen Vorfahren (last universal common ancestor,ein Organismus aus dem sich die drei Reiche Bacteria, Archaea und Eukaryoten entwickelt haben) bereits vorhanden gewesen sein könnten. DieseIntron-early-Hypothese wird gestützt durch die Entdeckung unterschiedlicher Introns in den Genomen von Mitochondrien, Archaea und Viren. Bacteria müssten laut dieser Theorie ihre Introns eingebüßt haben, was durch eine Optimierung des Genoms für eine rasche Proliferation und kurze Generationsdauer erklärt werden könnte. Im Gegensatz dazu scheinen zumindest einige der Introns dieser Theorie nicht zu entsprechen, da sie sich vermutlich aus anderen Vorläufersequenzen entwickelt haben. Demnach mag es kein „Ur-Intron “gegeben haben (aus dem alle heutigen Introns hervorgegangen sind), sondern vielmehr mehrere Sequenzen als Vorfahren für die heute bekannten Introns. Somit wären Introns nichtmonophyletisch,sondern würden am ehesten einerpolyphyletischenGruppe entsprechen. Dieser Zusammenhang wird in derIntron-late-Hypothese formuliert.

Siehe auch

• Alternatives Spleißen
• Spliceosom

Literatur

• James E. Darnell,Harvey Lodish,David Baltimore:Molekulare Zellbiologie.de Gruyter, Berlin u. a. 1993,ISBN 3-11-011934-X(4. Auflage. Harvey Lodish:Molekulare Zellbiologie.Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg u. a. 2001,ISBN 3-8274-1077-0).
• Benjamin Lewin:Molekularbiologie der Gene.Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg u. a. 1998,ISBN 3-8274-0234-4.
• William S. Klug, Michael R. Cummings, Charlotte A. Spencer:Genetik.8., aktualisierte Auflage. 2007,ISBN 978-3-8273-7247-5.

Weblinks

• mRNA splicing (Animation)aus Alberts u. a., Essential Cell Biology.