Ir al contenido

CRISPR

De Wikipedia, la enciclopedia libre
CRISPR
CRISPR + fragmentos de ADN de E.Coli.
Identificadores
Organismo E.Coli
Símbolo ?
Otros datos


Diagrama del posible mecanismo de los CRISPR.[1]​

CRISPR(eninglés:Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,enespañol:repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas[2]​) es una familia de secuencias deADNde origen viral que se encuentran integradas en elgenomade los organismosprocariotas.Dichas secuencias consisten en fragmentos de ADN devirusbacteriófagosque han infectado abacteriasyarqueasen el pasado y que estas han incluido en su propiocódigo genético.Estos fragmentos son utilizados por lacélula procariotaen el futuro para detectar y destruir elmaterial genéticode virus infecciosos similares medianteproteínasque, con base en las secuencias integradas de ataques anteriores, reconocen y cortan el nuevo ADN viral dejándolo inutilizado, funcionando como unsistema inmunitariode defensa procariota eficaz y altamente específico. Además de jugar un papel clave en los sistemas de defensa bacterianos, estas secuencias formaron la base de una revolucionaria tecnología de vanguardia conocida comoCRISPR/Cas,que es capaz de modificar los genes de cualquier organismo utilizando una familia deenzimascon actividadendonucleasaasociadas a CRISPR conocidas como Cas, tal como laCas9del sistema CRISPR/Cas9.

En términos más técnicos, los arreglos CRISPR sonlocideADNque contienen repeticiones cortas de secuencias debases.Tras cada repetición siguen segmentos cortos de "ADN espaciador"proveniente de exposiciones previas a unvirus.[3]​ Se encuentran en aproximadamente el 40% de los genomasbacterianosy en el 90% de los genomas secuenciados de lasarqueas.[4]​[5]​ Con frecuencia se hallan asociados con losgenes casque codifican para proteínasnucleasasconocidas como Cas relacionadas con los CRISPR. El sistema CRISPR/Cas es unsistema inmunitarioprocarióticoque confiere resistencia a agentes externos comoplásmidosybacteriófagos[6]​[7]​ y provee una forma deinmunidad adquirida.Los espaciadores de los CRISPR reconocen secuencias específicas y guían a las nucleasas Cas para cortar y degradar esos elementos génicos exógenos de una manera análoga alARNien sistemas eucarióticos.[3]​

Desde 2013 el sistema CRISPR/Cas se ha utilizado para laedición de genes(agregando, interrumpiendo o cambiando las secuencias de genes específicos) y para la regulación génica en varias especies.[8]​ Al administrar la proteínaCas9y los ARN guía apropiados a una célula, el genoma de esta puede cortarse en los lugares deseados, cuyas secuencias serán complementarias a las de los ARN guía utilizados. Esto permite la eliminación funcional de genes o la introducción de mutaciones (tras la reparación del corte realizado por la maquinaria celular de reparación del ADN) para estudiar sus efectos. Modificaciones recientes del sistema CRISPR/Cas9 permiten también actuar sobre la transcripción de los genes, modificando así solo su nivel de funcionamiento, pero no la información genética. Los investigadores plantean que los CRISPRs quizás puedan usarse para construir sistemas de entrega de genes guiados por ARN que lleguen a alterar los genomas de poblaciones enteras.[9]​

Antecedentes

[editar]

Las bacterias pueden incorporar ADN externo en otras circunstancias e incluso pueden tomar ADN dañado de su medio.[10]​

Las secuencias repetidas que luego se conocerían como CRISPR fueron identificadas por primera vez por un grupo de científicos japoneses en 1987 (Yoshizumi Ishinoet al).[11]​[12]​ y luego más tarde de forma independiente por el científicoFrancisco J. M. Mojica(Universidad de Alicante) a principios de los años 90 en unaarqueaHaloferax mediterraneiy los resultados fueron publicados en 1993,[13]​ tras haber sido anteriormente descritas en bacterias (Escherichia coli[12]​ yMycobacterium bovis[14]​). Inicialmente fueron utilizadas para el tipado de bacterias, para diferenciar distintos aislados, cepas y especies.[15]​ Estudios iniciales por Francisco J. M. Mojica y colaboradores postularon el posible papel de estas secuencias en la partición de replicones.[16]​ En el año 2000, Francisco J. M. Mojica y colaboradores detectaron un gran número de estas secuencias repetidas en bacterias, arqueas y mitocondrias y propusieron el nombre deShort Regularly Spaced Repeats(SRSR, en castellano "Repeticiones Cortas Regularmente Espaciadas".[17]​ Pocos años después, Francisco J. M. Mojica propuso y acuñó el acrónimoCRISPR(del inglés:Clustered Regularly Interspaced Short Palyndromic Repeats), propuesta que quedó recogida en una publicación de microbiólogos holandeses en 2002[18]​ y que sería utilizada universalmente desde entonces para referirse a estas secuencias. También, en la misma publicación, se describió por vez primera un conjunto de genes, algunos de los cuales codificannucleasasohelicasasputativas, asociados a las secuencias repetidas CRISPR (los genescasoasociados a CRISPR:del inglés:CRISPR associated).[18]​

Diagrama simplificado de un locus CRISPR, donde se muestran sus tres componentes mayoritarios: los genescas,una secuencia líder y un arreglo de repeticiones-espaciadores. las repeticiones se muestran como cajas grises y los espaciadores son las barras de color. El arreglo de esos tres componentes no siempre es como se muestra.[1]​[3]​ Además, en el mismo genoma pueden presentarse varios CRISPRs con un DR similar, de los cuales solo uno esté asociado con los genes cas.[5]​

En 2005, tres grupos de investigación independientes mostraron que algunos de los espaciadores de los CRISPRs se derivan de diversas fuentes de ADN como ADN defagosy ADN extracromosomal como losplásmidos.[19]​[20]​ Nuevamente fue el grupo de Francisco J. Mojica quien primero se dio cuenta de que las secuencias CRISPR y los espaciadores asociados podían formar parte de algún sistema inmune propio de estos microorganismos procarióticos, quien primero estableció la relación entre CRISPR e inmunidad.[21]​ Esas observaciones clave indican que el sistema CRISPR/cas puede tener un rol en lainmunidad adaptativaen las bacterias.[1]​ Koonin y sus asociados[22]​ propusieron que los espaciadores sirven como plantilla para moléculas de ARN, análogo a un sistema que usan los eucariontes llamadointerferencia por ARN.

En 2007 Barrangou, Horvath (científicos de la industria alimenticia enDanisco) y el grupo de Moineau en laUniversité Laval(Canadá) mostraron que podían alterar la resistencia deStreptococcus thermophilusa ataques de fagos con ADN espaciador.[22]​

Cas9

[editar]

Jennifer DoudnayEmmanuelle Charpentier,ganadoras del Premio Nobel de Química 2020, junto conFrancisco Juan Martínez Mojica,habían estado explorando de manera independiente a las proteínas asociadas a CRISPR para aprender cómo las bacterias utilizan a los espaciadores en sus sistemas inmunes. Juntos estudiaron un sistema CRISPR más simple que se basa en una proteína llamadaCas9.Encontraron que las bacterias responden ante un fago invasor al transcribir espaciadores y ADN palindrómico en una larga molécula de ARN y que entonces la célula utilizaba un ARN llamadoTrans-activating crRNA(tracrRNA) y también Cas9 para cortarla en pedazos llamadosARNcr.[22]​

Cas9 es unanucleasa,una enzima especializada en cortar ADN, con dos sitios de corte activos (HNHyRuvC), uno para cada hebra de ladoble hélice.El equipo demostró que podrían desactivar uno o ambos sitios preservando la habilidad de Cas9 de ser específico para su ADN objetivo. Jinek combinó al tracrRNA y ARN espaciador para formar una molécula llamadasingle-guide RNAque, al combinarse con Cas9, podía encontrar y cortar los blancos correctos de ADN. Jinek propuso que estos ARN guía sintéticos podrían usarse para la edición de genes.[22]​

La primera vez que se mostró que CRISPR funcionaba como una herramienta deingeniería genéticaen cultivos de células humanas fue en 2012.[23]​[24]​ Desde entonces se ha utilizado en muchos organismos, incluida lalevadura del pan(Saccharomyces cerevisiae),[25]​ el pez cebra (Danio rerio),[26]​ la mosca de la fruta (Drosophila melanogaster),[27]​nematodos(Caenorhabditis elegans)[28]​ plantas[29]​ yratones,[30]​ entre otros.

Adicionalmente, CRISPR ha sido modificada para hacer factores de transcripción programables que permiten a los científicos silenciar o activar ciertos genes.[31]​

Existen ahora librerías con decenas de miles deARN guía.[22]​

La primera evidencia de que CRISPR puede revertir síntomas de enfermedad en organismos vivos fue demostrada en marzo de 2014, cuando investigadores delMITcuraron a ratones dedesórdenes genéticos del hígado.[32]​

Cas12a (anteriormente Cpf1)

[editar]

En 2015, la nucleasaCpf1se descubrió en el sistemaCRISPR/Cpf1de la bacteriaFrancisella novicida.[33]​[34]​ Cpf1 mostró varias diferencias claves de Cas9 incluyendo: causando un corte 'escalonado' en el ADN de doble hebra, en oposición al corte 'brusco' producido por Cas9, basándose en un PAM rico en T (proporcionando sitios de orientación alternativos a Cas9) y requiriendo solamente Un CRISPR ARN (CRRNA) para el éxito de la orientación. Por el contrario Cas9 requiere tanto crARN y un crARN trans activado (tracrRNA)).

Actualmente esta nucleasa recibe el nombre deCas12a,y presenta algunas variantes en función del organismo de origen, entre las que se encuentran AsCas12a (presente en la bacteriaAcidaminococcus), y LbCas12a (presente enLachnospiraceae bacterium). Además, en esta última variante se descubrió una mutación puntual, D156R, que representa la sustitución del aminoácido ácido aspártico por arginina en la posición 156 de la proteína. Cas12aD156Rmuestra un aumento en la eficiencia de corte en el modelo vegetalArabidopsis thaliana,similar al que después se corroboró enD. melanogaster,generando una eficiencia en la tasa de edición génica próxima a la observada en Cas9.[35]​

CasΦ

[editar]

Se trata de una nucleasa hipercompacta descrita en 2020 que representa la mitad del peso molecular de Cas9/Cas12 y con características similares en su utilización como herramienta para la edición génica.[36]​ Además, se ha adaptado de forma exitosa a la ediciónin vivoenDrosophila melanogasterde forma precisa sin generar cortes en el ADN de doble cadena.[37]​

Predecesores para edición génica

[editar]

Al inicio de la década de los 2000, investigadores desarrollaron lasnucleasas con dedos de zinc,proteínas sintéticas cuyas regiones de unión a ADN les permitían cortar el ADN en puntos específicos. Después, lasnucleasas sintéticasllamadasTALENsdieron una vía más sencilla para llegar a ADN específico y se predijo que sobrepasarían a las de los dedos de zinc. Ambas dependen de la elaboración de proteínas específicas para cada ADN objetivo, un procedimiento bastante más complicado que los ARN guía. Los CRISPRs son más eficientes y pueden llegar a más genes que ambas técnicas.[38]​

Primera edición génica comunicada en julio de 2017

[editar]

El 12 de julio de 2017 la revista británicaNaturecomunicó un trabajo recibido el 22 de agosto de 2016, comunicando que investigadores de la Universidad de Harvard modificaron en el genoma de un grupo de bacterias, por medio de corta-pega o copipasteo genético logrado con la técnica CRISPR, la información digital de una fotografía y un GIF o animación corta. Después secuenciaron el ADN de los microorganismos para recuperar la imagen y el video con una precisión del 90%.[39]​ El avance atrajo nuevo interés científico en el campo de la ‘grabación molecular’ y en particular conjeturas, al parecer prematuras e inexactas, sobre la memorización en sistemas accedidos desde unpsiquismo.

Estructura del locus

[editar]

Repeticiones y espaciadores

[editar]

Los loci de CRISPR van de 24 a 48pares de bases.[40]​ Las repeticiones están separadas por espaciadores de longitud similar.[40]​ Algunas secuencias espaciadoras de CRISPR son complementarias a las de losplásmidosyfagos,[19]​[21]​[20]​ aunque algunos espaciadores se complementan con el genoma procarionte (espaciadores autoreplicativos).[19]​[41]​ Pueden añadirse rápidamente espaciadores nuevos como respuesta a una infección por un fago.[42]​

Genes cas y subtipos de CRISPR

[editar]

Los genes asociados a CRISPR, llamadoscas,son genes frecuentemente relacionados con los arreglos de repeticiones CRISPR. Análisis extensivos de genómica comparativa han identificado a muchos genes cas diferentes; un análisis inicial de 40 genomas de bacterias y arqueas sugirió que podría haber 45 familias de genes cas, con solo dos genes, cas1 y cas2, siendo omnipresentes.[40]​ El sistema actual de clasificación de CRISPR agrupa a los operones en cas en tres grupos mayores, cada uno con múltiples subdivisiones basadas en filogenia de cas1 y en el complemento del operón del gen cas.[43]​ Aparte de cas1 y cas2, las tres divisiones mayores tienen conjuntos muy diferentes de genes constitutivos, con cada una de las divisiones conteniendo un ‘gen característico’ encontrado exclusivamente en esa subdivisión. Muchos organismos contienen múltiples sistemas CRISPR-Cas sugiriendo que son compatibles e incluso podrían compartir elementos.[44]​ La distribución esporádica de los subtipos de CRISPR/Cas sugiere que el sistema está sujeto a latransferencia genética horizontaldurante la evolución microbiana.

Genes característicos y sus funciones putativas para los tipos mayores y menores de CRISPR-Cas
Tipo Cas Gen característico Función Referencia
I Cas3 Nucleasa para ADN de cadena sencilla. Helicasa dependiente de ATP [45]​
IA Cas8a Subunidad del módulo de interferencia [46]​
IB Cas8b
IC Cas8c
ID Cas10d Contiene un dominio homólogo al dominio de las polimerasas de ácidos nucleicos y ciclasas de nucleótidos [43]​[47]​
IE Cse1
IF Csy1 Indeterminado
II Cas9 LasnucleasasRuvC and HNH, juntas, producencortes en cadena doble,y de manera separada pueden producir cortes en cadena sencilla [48]​
IIA Csn2 Indeterminado
IIB Cas4 Indeterminado
IIC Caracterizado por la ausencia ya sea de Csn2 o Cas4 [49]​
III Cas10 Homólogo de Cas10d y Cse1 [47]​
IIIA Csm2 Indeterminado
IIIB Cmr5 Indeterminado

Mecanismo

[editar]
Las etapas de inmunidad CRISPR por cada uno de los tres tipos mayores de inmunidad adaptativa. (1) Comienza la adquisición por el reconocimiento de ADN invasor por Cas1 and Cas2 y hay corte de un protoespaciador. (2) El protoespaciador se liga a repetidos directos adyacentes a la secuencia líder y (3) la extensión de cadena sencilla repara el CRISPR y duplica el repetido directo. El procesado e interferencia de ARNcr ocurren diferentemente en cada uno de los tres sistemas mayores de CRISPR. (4) El transcrito primario de CRISPR es cortado por los genes cas para producir ARNcr. (5) En sistemas tipo I, Cas6e/Cas6f cortan en la unión de ARN de cadena sencilla y ARN de cadena doble formada por vueltas tipo "hairpin" en el repetido directo. Los sistemas tipo II usan un ARN trans-activador (tracr) para formar ARN de cadena doble, el cual es cortado por Cas9 y la RNasaIII. Los sistemas tipo II usan un homólogo de Cas 6 que no requiere vueltas tipo hairpin en los repetidos directos para efectuar el corte. (6) En los sistema II y III, se hace un recorte secundario ya sea en el extremo 5’ o 3’ para producir ARNcr maduros. (7) Los ARNcr maduros se asocian con las proteínas cas para formar complejos de interferencia. (8) En sistemas tipo I y II, el apareamiento de bases entre el ARNcr y el PAM provoca la degradación del ADN invasor. En el tipo III, los sistemas no requieren PAM para la degradación exitosa y el apareamiento de bases en los sistemas tipo III-A ocurre entre ARNcr y ARNm en vez de con ADN, dirigido por los sistemas tipo III-B.

Adquisición de los espaciadores dentro de los loci de los CRISPR

[editar]

Capturar al ADN invasor e integrarlo en un locus CRISPR en forma de un espaciador es la primera etapa en la respuesta inmune. La prevalencia de cas1 y cas2 fue la primera pista de que estaban involucrados en la adquisición de los espaciadores ya que todos los CRISPRs comparten la estructura repetitiva regular. Estudios de mutaciones confirmaron esta hipótesis ya que al remover cas1 o cas2 impedía la adquisición de espaciadores, sin afectar la respuesta inmune CRISPR en sí.[46]​[50]​[51]​[52]​[53]​ La función exacta de Cas1 y Cas2 se desconoce, sin embargo un número de proteínas Cas1 se han caracterizado bioquímicamente y se han resuelto sus estructuras.[54]​[55]​[56]​ Las proteínas Cas1 tienen secuencias de aminoácidos muy diversas, sin embargo sus estructuras cristalinas son sorprendentemente similares y todas las cas1 purificadas son nucleasas dependientes de metales que se unen a ADN en modo independiente de secuencia.[44]​ Las proteínas Cas2 representativas también han sido caracterizadas y poseen actividad específica de endorribonucleasa ya sea para ARN de cadena sencilla o ADN de cadena doble[57]​[58]​[59]​ Los datos funcionales y estudios de mutación genética sugieren que Cas1 y Cas2 cortan fragmentos de ADN invasor y los insertan en arreglos CRISPR.

El análisis bioinformático de regiones de genomas de fagos que fueron cortados como espaciadores (denominados protoespaciadores) reveló que estos no estaban distribuidos aleatoriamente sino más bien se encontraban adyacentes a secuencias cortas de ADN (de 3 a 5 pb) llamadasPAMs (protospacer adjacent motifsen inglés).[60]​ El análisis de los sistemas CRISPR-Cas de las tres divisiones mayores han mostrado que los PAMs son importantes para los sistemas tipo I y II, pero no para el III durante el proceso de adquisición de espaciadores.[20]​[61]​[62]​[60]​[63]​[64]​ En sistemas tipo I y II, los protoespaciadores se cortan en posiciones adyacentes a una secuencia PAM, con el otro extremo del espaciador siendo cortado con un mecanismo tipo regla inherente a la proteína Cas1, manteniendo así la regularidad en tamaño de los espaciadores a lo largo del arreglo de CRISPR.[65]​[66]​ La conservación de la secuencia PAM difiere entre los sistemas CRISPR-Cas y parece estar ligada evolutivamente a cas1 y a la secuencia líder.[64]​[67]​

Los nuevos espaciadores se añaden a un arreglo de CRISPR en un modo direccional,[19]​ ocurriendo preferencialmente[61]​[62]​[68]​[42]​[69]​ pero no exclusivamente, en forma adyacente[63]​[66]​ a la secuencia líder. El análisis del sistema tipo I-E de E. coli ha demostrado que la primera repetición directa, adyacente a la secuencia líder, es copiado, con el espaciador recientemente adquirido siendo insertado entre la primera y segunda repeticiones directas.[52]​[65]​ La secuencia PAM también parece ser importante durante la inserción de espaciadores de sistemas tipo I-E. La secuencia PAM del sistema I-E contiene un nucleótido final fuertemente conservado (adyacente al primer nucleótido del protoespaciador) y se ha mostrado que este nucleótido se convierte en la base final en la primera repetición directa.[53]​[70]​[71]​ Esto sugiere que la maquinaria de adquisición de espaciadores genera overhangs de cadena sencilla en la penúltima posición de la repetición directay en el PAM durante la inserción del espaciador. Sin embargo no todos los sistemas CRISPR-Cas parecen tener este mecanismo ya que los PAMs caracterizados en otros organismos no muestran el mismo nivel de conservación en la posición final.[67]​ Es probable que en esos sistemas, un extremo romo es generado al final de la repetición directa y el protoespaciador durante la adquisición. Análisis reciente de CRISPRs deSulfolobus solfataricushan revelado más complejidades al modelo canónico de la inserción de espaciadores ya que uno de sus seis locus insertó espaciadores de manera aleatoria a lo largo de su arreglo CRISPR, opuesto a una inserción más cercana a la secuencia líder.[66]​

Ha sido notado en una cantidad de CRISPRs que estos contienen muchos espaciadores para el mismo fago. El mecanismo que causa este fenómeno ha sido dilucidado recientemente en el sistema tipo I-E de E. coli. Una mejora significativa en la adquisición de espaciadores ha sido detectada donde ya hay espaciadores con el fago como objetivo inclusive con "desajustes" al protoespaciador. Este ‘cebado’ requiere que tanto las proteínas Cas involucradas en adquisición como en interferencia interactúen entre sí. Los espaciadores nuevamente adquiridos que resultan del mecanismo de cebado siempre se encuentran en la misma cadena que la del espaciador original que produjo el cebado.[53]​[70]​[71]​ Esta observación ha llevado a la hipótesis de que la maquinaria de adquisición recorre el ADN extraño después del cebado para encontrar un nuevo protoespaciador.[71]​

Etapa de interferencia

[editar]

La respuesta inmune por CRISPR ocurre en dos etapas: la biogénesis de CRISPR-ARN (ARNcr) y la interferencia guiada por ARNcr. Un arreglo de CRISPR es transcrito de un promotor en el líder en un solo transcrito largo.[46]​[72]​[73]​ Este transcrito es procesado por cortes dentro de las secuencias repetidas para formar ARNcr. Los mecanismos para producir ARNcr maduros varían de gran manera entre los tres sistemas principales de CRISPR-Cas. Tanto en sistemas del tipo I-E como I-F las proteínas Cas6e y Cas6f respectivamente, reconocen giros[74]​[75]​[76]​ creados por la naturaleza palindrómica de las repeticiones directas.[77]​ Esas proteínas cortan el transcrito primario en la unión entre los ARN de cadena sencilla y doble, dejando un extremo 5ʹ de 8 nucleótidos originado de la repetición en los ARNcr maduros y con una secuencia espaciadora. Los sistemas tipo III también usan Cas6, sin embargo, sus repeticiones no producen girosstem-loops, sino que la escisión ocurre por el "enroscamiento" del transcrito primario a lo largo de la Cas6 para permitir la división justo antes de la secuencia de repetición.[78]​[79]​[80]​ Los sistemas tipo II no poseen el gen Cas6 así que utilizan a la ARNsaIII para hacer los cortes. Los sistemas funcionales tipo II codifican un pequeño ARN adicional que es complementario a la secuencia de las repeticiones conocido como ARN trans-activador(tracrRNA).[50]​ La transcripción del tracrRNA y del transcrito primario CRISPR resulta en emparejamiento de bases y la formación de ARN de doble cadena en la secuencia de repeticiones, la cual es subsecuentemente cortada por la ARNasaIII para producir ARNcr. A diferencia de los otros dos sistemas el ARNcr no contiene el espaciador completo, está truncado en un extremo por diez nucleótidos.[48]​

Los ARNcr se asocian con las proteínas Cas para formar complejos de ribonucleótidos que reconocen ácidos nucleicos extraños. Experimentos con fagos y plásmidos han indicado que los ARNcr no tienen preferencia por cadenas codificantes o no codificantes, lo cual indica un sistema específico para ADN guiado por ARN.[7]​[46]​[53]​[81]​[82]​[83]​[84]​ El complejo tipo I-E (llamado Cascade de forma común) requiere cinco proteínas Cas arregladas en una configuración que recuerda a un caballo de mar, unidas al ARNcr de cadena sencilla que está unido a lo largo del "lomo".[85]​[86]​ Durante el estado de interferencia en los sistemas tipo I la secuencia PAM es reconocida en la cadena complementaria al ARNcr y se requiere junto con el apareamiento de ARNcr. En los sistemas tipo I, el correcto emparejamiento entre el ARNcr y los protoespaciadores señaliza un cambio conformacional en Cascade que recluta a Cas3 para la degradación del ADN.

Los sistemas de tipo II utilizan una proteína multifuncional, Cas9, para el paso de interferencia.[48]​ La Cas9 requiere tanto al ARNcr como al tracrRNA para funcionar y corta al ADN usando sus dominios duales de endonucleasa: HNH y RuvC. El apareamiento de bases entre el PAM y el genoma del fago también se requiere en los sistemas tipo II, sin embargo el PAM es reconocido en la misma cadena que el ARNcr (la cadena opuesta a los sistemas tipo I).

Los sistemas tipo III, como los de tipo I, requieren un complejo multiproteico para asociarse con el ARNcr. Análisis bioquímicos y estructurales de S. solfataricus y Pyrococcus furiosus han dilucidado que seis o siete proteínas cas se unen a los ARNcr, respectivamente.[87]​[88]​ Sorpredentemente, los sistemas tipo III analizados en S. solfataricus y P. furiosus son específicos para el ARNm de fagos y plásmidos,[89]​[88]​ lo cual puede hacer a esos sistemas capaces de ser específicos para genomas de fagos basados en ARN.[44]​ El mecanismo para distinguir ADN propio del externo durante la interferencia está dentro de los ARNcr y por lo tanto se infiere que es conservado en los 3 sistemas. Aun a través del proceso de maduración distintiva de cada uno de los tipos, todos los ARNcr contienen una secuencia espaciadora y una porción de la repetición en uno o ambos extremos. Es la secuencia parcial de repeticiones la que previene que el sistema CRISPR-Cas ataque al cromosoma ya que el apareamiento de bases más allá de la secuencia del espaciador es una señal de que pertenece a sí mismo y previene el corte de ADN en el cromosoma.[90]​ Las enzimas de CRISPR guiadas por ARN se clasifican comoenzimas de restriccióntipo V.

Proteína asociada a CRISPR
Estructura cristalina de una proteína asociada a CRISPR de Thermus thermophilus
Identificadores
Símbolo CRISPR_assoc
Pfam PF08798
clanPfam CL0362
InterPro IPR010179
CDD cd09727
Proteína asociada a CRISPR Cas2
]
Estructura cristalina de la proteína hipotética tt1823 de Thermus thermophilus
Identificadores
Símbolo CRISPR_Cas2
Pfam PF09827
InterPro IPR019199
CDD cd09638
Proteína asociada a CRISPR Cse1
Identificadores
Symbol CRISPR_Cse1
Pfam PF09481
InterPro IPR013381
CDD cd09729
Proteína asociada a CRISPR Cse2
Identificadores
Símbolo CRISPR_Cse2
Pfam PF09485
InterPro IPR013382
CDD cd09670

Mutaciones aleatorias

[editar]

En 2017 se demostró en un estudio[91]​ que este tipo de ingeniería genética puede generar centenares de mutaciones aleatorias no esperadas.

Dos días después de esta publicación, la reconocida revista Science publica un artículo que pone en entredicho la veracidad de este estudio crítico.[92]​ Diferentes estudios anteriores muestran un alto nivel de especificidad de CRISPR.[93]​[94]​[95]​

Para la comprobación de estas mutaciones aleatorias o fuera de la región diana ("off targets"en inglés) de las guías diseñadas han surgido herramientas de estudio de estas regiones de una forma automatizada como la herramienta VIVO.[96]​[97]​ VIVO es un “sistema de detección in vivo deoff-targets”.Esta herramienta es un método eficiente para la detección de las zonas de edición fuera de la región diana a la cual orientamos las guías RNA del sistema de edición genómica CRISPR /Cas. Actualmente es el único método que cuenta con una observación inicialmente in vitro de los posiblesoff-targetsde las guías con una posterior comprobación in vivo de la acción real de las guías RNA. El sistema VIVO nos permite detectar y cuantificar las regiones fuera de la diana o"target"de las nucleasas, de esta forma se busca definir que generando una guía RNA bien diseñada esta carece deoff-targetso mutaciones aleatorias.

El sistema VIVO se compone de dos etapas consecutivas:

a) CIRCLEseq: es un método in vitro para la determinación de los posiblesoff-targetsque puede generar una RNA guía en unas células determinadas. Esta etapa se basa en la localización de regiones del DNA donde pueda producir un corte laCas9debido a que estas regiones son complementarias a los RNA guías diseñados. Esas regiones del DNA se cortan y se anillan, dando lugar a fragmentos circulares de DNA con regiones para el corte mediado por Cas9 y otras sin región reconocida por la Cas9 que se van a degradar mediante un tratamiento con exonucleasas. Los fragmentos circulares deseados se someten a una linealización mediante el uso de la Cas9.Los fragmentos lineales adquieren un ligando adaptador, se someten a PCR y posteriormente se analizan mediante técnicas de secuenciación. Cada una de las secuencias obtenidas corresponderá a un posibleoff-targetde la Cas9 mediante el uso de las guías diseñadas.

b) Comprobación in vivo: a partir de los datos obtenidos mediante CIRLCE seq se comprueba que realmente se produce un corte en esas regiones del DNA mediante la Cas9 in vivo.Para ello se utiliza un tejido al que se aplica las Cas9 y se observa si las regiones predichas por CIRCLE seq realmente se cortan por las nucleasas.

Evolución, diversidad

[editar]

Estudios enStreptococcus thermophilusfueron los primeros indicativos de cómo los CRISPRs mueven a la evolución defagosy bacterias. Un espaciador CRISPR debe corresponder perfectamente a la secuencia del gen objetivo del fago. Los fagos pueden seguir infectando a sus hospederos cuando hay mutaciones puntuales en el espaciador.[90]​ Se siguen requerimientos similares en el PAM o la cepa seguirá siendo sensible a fagos.[62]​[90]​ El modelo básico de evolución CRISPR se explica como el modelo donde los espaciadores recientemente incorporados llevan a los fagos a mutar sus genomas creando diversidad en las poblaciones tanto de fagos y bacterias.

La evolución CRISPR ha sido estudiada usando lagenómica comparativade muchas cepas deS. thermophilus,Escherichia coliySalmonella enterica.Un estudio de 124 cepas deS. thermophilusmostró que 26% de todos los espaciadores eran únicos y que los diferentes locus de CRISPR mostraban diferentes tasas de adquisición de espaciadores.[61]​ Los resultados mostraron que un locus de CRISPR particular puede evolucionar más rápidamente que otros, lo cual ayuda a establecer relaciones filogenéticas entre cepas. Un análisis similar de cepas deE. coliyS. entericareveló que evolucionaron mucho más lentamente queS. thermophilus.Las cepas de esta última que habían divergido hace más de 250,000 años todavía contenían el mismo complemento de espaciador.[98]​

La diversidad de CRISPR se estudió en múltiples comunidades ambientales usandometagenómica.El análisis de losbiofilmsde los drenajes ácidos de dos minas mostró que uno de los CRISPRs analizados contenía deleciones y espaciadores extensivos en comparación con el otro biofilm, lo cual sugiere una mayor actividad de fagos en una comunidad que en otra.[42]​ En la cavidad oral, un estudio temporal determinó que aproximadamente del 7 al 22% de los espaciadores eran compartidos en períodos en el tiempo a lo largo de 17 meses en un mismo individuo y menos del 2% de los espaciadores fueron compartidos entre diferentes individuos en cualquier período en el tiempo.[69]​ Del mismo ambiente, se aisló una cepa particular usandoprimersdePCRespecíficos para su CRISPR. A diferencia de los resultados generales de la presencia/ausencia de los espaciadores, los cuales mostraban diversidad significativa, este CRISPR añadió 3 espaciadores a lo largo de 17 meses,[69]​ lo que sugiere que incluso en un ambiente con diversidad importante de CRISPR algunos locus evolucionan lentamente. Los CRISPRs también han sido analizados desde losmetagenomasproducidos por el proyecto delmicrobiomahumano.[99]​ Aunque la mayoría de los CRISPRs eran específicos en un sitio, algunos CRISPRs dentro del sitio eran ampliamente encontrados entre individuos. Uno de esos locus de CRISPR se originó con estudios de especies deStreptococcusy contuvieron ~15,000 espaciadores, 50% de los cuales eran únicos. De modo similar a los estudios dirigidos de la cavidad oral, algunos de los CRISPRs mostraron poca evolución entre períodos en el tiempo.[99]​

La evolución CRISPR ha sido estudiada enquimiostatosusando S. thermophilus para examinar de manera explícita la tasa de adquisición de espaciadores. En el período de una semana, cepas deS. thermophilusadquirieron hasta tres espaciadores cuando eran expuestos ante solo un fago.[100]​ En el mismo periodo de tiempo, el fago desarrolló variosSNPsque se quedaron fijos es la población, lo que sugiere que CRISPR había prevenido la replicación de todos los otros tipos de fagos sin estas mutaciones.[100]​ Otros experimentos, también conS. thermophilus,mostraron que los fagos pueden infectar y replicarse en hospederos que tienen solo un espaciador y que los hospederos sensibles existen en ambientes con altas concentraciones de fagos.[101]​ Los estudios por quimiostatos y observaciones en los CRISPRs sugieren muchas consecuencias al resultado de la evolución de CRISPR y fagos.

Identificación bioinformática de los CRISPR en genomas y metagenomas

[editar]

Los CRISPRs están altamente distribuidos entre bacterias y arqueas[43]​ y muestran similitudes en las secuencias,[77]​ sin embargo su característica principal son sus espaciadores repetidos y repeticiones directas. Esta característica hace a los CRISPRs fáciles de identificar en largas secuencias de ADN, ya que el número de copias repetidas disminuye la posibilidad de una unión tipo falso positivo. En la actualidad hay tres programas utilizados para la identificación de repeticiones CRISPR que buscan repeticiones interespaciadas en secuencias grandes: CRT,[102]​ PILER-CR[103]​ y CRISPRfinder.[104]​

El análisis de los CRISPRs en los datos de metagenómica es mucho más exigente, ya que los locus de CRISPR no suelen ensamblarse debido a su naturaleza repetitiva ni por variación de cepas, lo cual confunde a los algoritmos. Mientras que hay muchos genomas de referencias disponibles, la PCR se puede utilizar para amplificar matrices CRISPR y así analizar el contenido de los espaciadores.[61]​[69]​[105]​[106]​[107]​ Sin embargo, este enfoque solamente dará información de CRISPRs específicamente buscados y en organismos con suficiente representación en bases de datos públicas para poder hacer el diseño de primers de PCR confiables.

El enfoque alterativo es extraer y reconstruir matrices CRISPR basándose en datos metagenómicos al azar. La identificación de los arreglos de CRISPR de lecturas metagenómias es una tarea computacionalmente más difícil, particularmente con las tecnologías de secuenciación de segunda generación (como son 454, Illumina), ya que las longitudes cortas previenen que más de dos o tres unidades repetidas se presenten en una sola lectura. La identificación de CRISPR en lecturas crudas se logra usando puramente identificación denovo[108]​ o al usar secuencias repetidas directas en arreglos CRISPR parcialmente ordenados[99]​ como herramienta para identificar repeticiones directos en lecturas individuales.

Importancia evolutiva

[editar]

Un estudiobioinformáticomostró que los CRISPRs son evolutivamente conservados y que se pueden aglomerar en tipos relacionados. Muchos muestran la posibilidad de una estructura secundaria conservada.[77]​

A través del mecanismo CRISPR/Cas, las bacterias pueden adquiririnmunidada ciertos fagos y por ende detener la consecuente transmisión de estos fagos. Por esta razón los CRISPR/Cas se describen como un mecanismo de herenciaLamarckiano.[109]​ Otros han investigado la coevolución de los genomas vitales y hospederos.[110]​

Las proteínasCas9están altamente enriquecidas en bacteriaspatogénicasy comensales. La regulación mediada por CRISPR/Cas puede contribuir a la regulación de los genes endógenos bacterianos, particularmente en la interacción bacteriana con hospederos eucariontes. Por ejemplo, la proteína Cas9 deFrancisella novicidausa un pequeño y único ARN asociado a CRISPR/Cas para reprimir un transcrito endógeno que codifica para una lipoproteína bacteriana que es crítica paraF. novicidapara reducir la respuesta del hospedero y promover la virulencia.[111]​

Aplicaciones

[editar]

La prueba que demostró el principio de la redirección específica del sistema CRISPR/Cas llegó en 2012[112]​ y fue un primer paso para la materialización de propuestas para la biotecnología derivada de CRISPR:[113]​

  • Inmunización artificial contra fagos por introducción de locus CRISPR en bacterias industrialmente importantes, incluyendo a esas utilizadas en la producción de comida y fermentaciones a gran escala.
  • Laingeniería genéticaa nivel celular u organísmico al reprogramar un sistema CRISPR/Cas para lograr ingeniería del genoma guiada por ARN. Los estudios lo han demostrado tantoin vitro[23]​[48]​ comoin vivo[30]​[114]​[115]​[116]​
  • Discriminación de cepas bacterianas por comparación de secuencias espaciadoras

Terapias

[editar]

Editas Medicine, unastart upde 43 millones de dólares, busca desarrollar tratamientos que usen CRISPR/Cas para hacer ediciones desde pares de bases específicas hasta segmentos más grandes de ADN. Algunas enfermedades heredadas como lafibrosis quísticay laanemiason causadas por mutaciones de un solo par de bases; la tecnología CRISPR/Cas tiene el potencial de corregir esos errores. El gen "corregido" permanece en su lugar habitual en sucromosoma,quien contiene la forma en que la célula normalmente activa o inhibe su expresión.[117]​

Después de cultivar precursores de células sanguíneas llamadoshemocitoblastosde lamédula óseade un paciente, la cirugía genética con CRISPR podría corregir el gen defectuoso. Entonces las células con el genoma corregido serían reintroducidas a la médula del paciente, que ahora producirá células sanas. Reemplazar el 70% de las células defectuosas significaría tener una cura.[38]​ Antes de que pueda usarse clínicamente, la compañía debe poder garantizar que solo la región objetivo será afectada y debe determinar cómo entregar la terapia a las células del paciente.[117]​ En 2014, investigadores de laUCSFusaron a los CRISPR para crear versiones sanas de células madre de pacientes conbeta-talasemia.[118]​ En 2020 la empresa CRISPR Therapeutics anunció que a junio de 2020, 5 pacientes con beta-talasemia, y dos pacientes con anemia falciforme, habían sido tratados exitosamente con CTX001.[119]​ CTX001 es una terapia en desarrollo que las empresas Vertex Pharmaceuticals y CRISPR Therapeutics tienen en desarrollo.[120]​ En la noticia se indicó que dos pacientes de beta-talasemia a los 5 y 15 meses después de la edición del gen que reprime la expresión del gen de la hemoglobina fetal (HbF) eran independientes de transfusiones; y que un paciente que presenta la enfermedad de células falciformes, o anemia falciforme, a los 9 meses de la edición CTX001 se presenta libre de las crisis vasooclusivas de la enfermedad.

Otras patologías que se podrían tratar con CRISPR incluyen la enfermedad de Huntington, los efectos de la vejez, esquizofrenia y autismo e inclusive la modificación de ADN en embriones vivos.[38]​

Mejorar el sistema de dirección es fundamental antes de que CRISPR pueda ser utilizado en aplicaciones médicas. Los ARN guía existentes podrían trabajar sobre secuencias que difieren en algunas pares de bases de la secuencia objetivo.[22]​

En 2017 dos mellizas chinas fueron modificadas genéticamente mediante CRISPR, modificando el gen CCR5, para conseguir que fueran resistentes contra elVIH,virus causante del sida que afectaba a su padre.[121]​[122]​[123]​

Modelos murinos

[editar]

CRISPR simplifica la creación de modelos de ratones y reduce el tiempo requerido de meses a tan solo semanas. Elknockdownde genes endógenos ha sido logrado por transfección con unplásmidoque contiene un área CRISPR con un espaciador, que inhibe un gen objetivo. La inyección de cigotos de ratón con Cas9 y dos ARN guía pudo lograr desactivar dos genes con el 80% de eficacia. La llamada reparación dirigida por homología involucra el uso de Cas9 para "cortar" al ADN, y así introducir nuevas partes génicas al cigoto.

Agricultura

[editar]
Librería de gusano de la seda con CRISPR Cas9

En 2014, el investigador chino Gao Caixia aplicó para patentes para la creación de una cepa detrigoque es resistente aloídio.A la cepa le faltan genes que producen proteínas que reprimen las defensas en contra del oídio. Los investigadores borraron todas las copias de los genes del genomahexaploidedel trigo. La cepa promete reducir o eliminar el gran uso defungicidaspara controlar la enfermedad. Gao usó los sistemas de edición génicatranscription activator-like effector nuclease(TALENs) y CRISPR para agregar o cambiar ningún otro gen. Aún no ha habido pruebas de campo.[124]​[125]​

Entomología

[editar]

En las células diploides eucariotas los análisis de perdida de función se han realizado primariamente por siRNA. En cambio, en los últimos años la tecnología CRISPR asociada a la proteína Cas9 ha adquirido una gran importancia. El sistema CRISPR es eficiente identificando genes en la resistencia de fármacos, tumorogénesis, respuesta inmune, interacciones con patógenos e inmunoterapia para el cáncer. Un ejemplo de esto es el estudio realizado enBombyx morique identificó los genes relacionados con su viabilidad celular, crecimiento, interacciones huésped-patógeno y resistencia a la temperatura, caracterizando más de 6000 genes diferentes.[126]​

Identificación de elementos funcionales en regiones genómicas no codificantes

[editar]

Marcadores molecularescomo el estadoepigenético,la accesibilidad a lacromatina,la vinculación defactores de transcripcióny la conservación evolutiva, se correlacionan con elementos funcionales putativos en el genoma no codificante y pueden predecir su función reguladora.[127]​ Sin embargo, estas predicciones superan en gran medida las regiones que carecen de características, y es difícil determinar qué características desempeñan un papel correlativo o verdaderamente causal en la función o en elfenotipo.

Los esfuerzos para determinar la causalidad se han basado en la utilización de fragmentos deADNpreseleccionados,[128]​ basándose en su expresión como sustituto de la función, pero estos métodos carecen del contexto de la cromatina local y de las interacciones reguladoras más amplias. Por lo tanto, existe la necesidad de enfoques sistemáticos para cribar variantes no codificantes y determinar si y cómo afectan a los fenotipos en un contexto biológico nativo. Para ello, se diseñó un método de alto rendimiento que utilizaba una biblioteca deARN guíaen CRISPR-Cas9 para la detección genómica delocusno codificantes con el fin de identificar las regiones funcionales relacionadas con el fenotipo y la regulación de genes. En combinación con otros ensayos de todo el genoma, se demuestra el alto rendimiento de la técnica en la identificación de las regiones donde los cambios en el contexto de la cromatina y factores de transcripción que se unen a estas regiones están causalmente vinculados a la pérdida deexpresión génicay un fenotipo relevante de la enfermedad.[129]​[130]​

Un ejemplo aplicado de esta técnica es la detección de localizaciones genómicas no codificantes que modulan la resistencia a los fármacos:

ElVemurafenibinhibe las proteínasB-Rafportadoras de lamutación[131]​ (cambio devalinaporglutamatoen la posición 600), que se encuentra en el 50 al 70% de losmelanomas.[132]​ La resistencia al vemurafenib surge en cuestión de meses en casi todos los pacientes con melanoma, y las células tumorales supervivientes muestran un aumento de lamalignidadque conduce rápidamente a la letalidad.[133]​[134]​ Una criba de CRISPR a escala genómica encontró que las mutaciones de pérdida de función en los genesNF1,NF2yCUL3producen resistencia a vemurafenib.[135]​ Para explorar si las mutaciones en las regiones no codificantes, alrededor de estos tres genes, podrían afectar de manera similar a la resistencia a los fármacos, se hizo uso de tres bibliotecas desgRNAsque mapeaban a lo largo de 100kb en las regiones 5' y 3' de las principalesisoformasde cada gen. Se concluyó que las mutaciones en la región no codificante 5' del gen CUL3 alteran los entornos locales epigenéticos y la interacción con distintos factores de transcripción (yin yang 1(YY1),zinc finger protein 263(ZNF263),CCCTC-binding factor(CTCF), y el complejoactivation-protein 1(AP-1) formado por Jun:Fos). Estas regiones no codificantes son de alta importancia en la regulación de genes y la resistencia quimioterapéutica y farmacológica.

Funciones

[editar]

Edición

[editar]

Los CRISPRs pueden agregar y eliminar pares de bases en locus de ADN altamente específicos. Se han usado los CRISPRs para cortar más de cinco genes a la vez.[22]​

Knockoutreversible

[editar]

Los "CRISPRi", análogos a los ARNi, tienen la capacidad de desactivar los genes en un modo reversible al ser específicos pero sin hacer cortes. En bacterias, la presencia es lo único que se necesita para detener la transcripción, pero en aplicaciones de mamíferos, una sección de proteína es añadida. Guía al ARN que es específico para el ADN regulatorio, que son promotores que preceden al gen de interés.[22]​

Activación

[editar]

LaCas9se usó para llevar factores de transcripción sintéticos (fragmentos proteicos que encienden genes) que activaban genes humanos específicos. Esta técnica logró un fuerte efecto al dirigir múltiples constructos de CRISPR a lugares ligeramente diferentes en el promotor del gen.[22]​

Los genes incluían algunos atados a enfermedades humanas, diferenciación muscular, cáncer, inflamación y de producción de hemoglobina fetal.[22]​

Uso por fagos

[editar]

Otro mecanismo para la defensa de las bacterias contra invasión de fagos es teniendoislas genómicas.Un subtipo de islas llamadaphage-inducible chromosomal island(PICI) es cortada del cromosoma bacteriano cuando se presenta la infección por fago y puede inhibir su replicación.[136]​ Los mecanismos que inducen el sistema PICI y cómo PICI inhibe la replicación del fago no se tienen entendidos hasta ahora. Un estudio mostró que el fago lítico ICP1, el cual específicamente ataca al serotipo 01 deVibrio choleraeha adquirido un sistema CRISPR/Cas que apunta a un elemento de tipo PICI enV. cholera.El sistema tiene dos locus CRISPR y 9 genes Cas. Parece ser que es homólogo al sistema 1-F system encontrado enYersinia pestis.Además, igual que el sistema bacteriano CRISPR/Cas el sistema ICP1 CRISPR/Cas puede adquirir nuevas secuencias, lo cual permite al fago co-evolucionar con su hospedador.[137]​

Automatización y soporte de librerías

[editar]

Existe unsoftwaregratuitopara diseñarARNy poder identificar cualquiergendeseado. El repositorio de Addgene ofrece a los académicos la posibilidad de crear su propio sistema” CRISPR system "por 65dólares.En 2013 Addgene distribuyó más de 10 000 constructos de CRISPR. La asociación ha recibido secuencias génicas activadoras de CRISPR de 11 equipos de investigación independientes.[22]​

Propiedad intelectual

[editar]

Hasta diciembre de 2014, losderechossobre la patente de CRISPR estuvieron impugnados.[138]​

El 12 de mayo de 2012 fue solicitada por el equipo de Doudna una aplicación de patente provisional sobre el uso del sistema CRISPR para laedición de genesy regulación de expresión génica. Fueron combinadas el 6 de marzo de 2014 aplicaciones subsecuentes. Los resultados fueron publicados por la oficina de patentes estadounidense (USPTO).[139]​ Los derechos de patente fueron asignados por los inventores a los regentes de laUniversidad de Californiay laUniversidad de Viena.

Por su parte,Feng Zhangen elBroad Institute,que había desarrollado y demostrado la tecnología CRISPR encélulashumanas,ha obtenido una patente de CRISPR para células con núcleo: células deanimales(incluidos los humanos) y deplantas.Según Zhang, las predicciones formuladas por Doudna en su propia aplicación de patente de que su descubrimiento podría funcionar en humanos fueron una "mera conjetura", mientras que él fue el primero en demostrarlo en un acto de invención separado y "sorprendente".[140]​ Esta segunda patente es controvertida, ya que otros científicos sugieren que, en términos depropiedad intelectual,era evidente que la tecnología CRISPR funcionaría en células humanas y por tanto la invención de Zhang no sería merecedora de una patente propia.[140]​ Desde diciembre de 2014 se espera que Doudna y Charpentier planteen su oposición contra la patente delBroad Institute.

En febrero de 2017, la Oficina de Patentes de los Estados Unidos se pronunció sobre un caso de interferencia de patente presentado por la Universidad de California con respecto a las patentes emitidas al Broad Institute, y encontró que las patentes Broad, con reivindicaciones que abarcaban la aplicación de CRISPR/cas9 en células eucariotas, eran distintas de los inventos reclamados por la Universidad de California.[141]​[142]​[143]​

Hasta noviembre de 2013,SAGE Labs(ahora parte del grupoHorizon Discovery) tenía derechos exclusivos de una de esas empresas para producir yvenderratasgenéticamente modificadasy derechos no exclusivos para modelos deratonesyconejos.[144]​ En 2015,Thermo Fisher Scientifichabía autorizado la propiedad intelectual deToolGenpara desarrollar kits de reactivos CRISPR.[145]​

Hay que aclarar que el sistema CRISPR fue descubierto por primera vez, por un grupo decientíficosjaponesesen 1987 liderado porYoshizumi Ishino,[11]​[12]​ años después fue encontrado de nuevo de forma independiente por elmicrobiólogoalicantinoFrancis Mojica,actualprofesortitular de laUniversidad de Alicante.[146]​[147]​

Cortadores alternativos

[editar]
  • CRISPR-DR2: Estructura secundaria tomada de la base de datos Rfam Familia RF01315.
    CRISPR-DR2:Estructura secundaria tomada de la base de datosRfamFamiliaRF01315.
  • CRISPR-DR5: Estructura secundaria tomada de la base de datos Rfam Familia RF011318.
    CRISPR-DR5:Estructura secundaria tomada de la base de datosRfamFamiliaRF011318.
  • CRISPR-DR6: Estructura secundaria tomada de la base de datos Rfam Familia RF01319.
    CRISPR-DR6:Estructura secundaria tomada de la base de datosRfamFamiliaRF01319.
  • CRISPR-DR8: Estructura secundaria tomada de la base de datos Rfam Familia RF01321.
    CRISPR-DR8:Estructura secundaria tomada de la base de datosRfamFamiliaRF01321.
  • CRISPR-DR9: Estructura secundaria tomada de la base de datos Rfam Familia RF01322.
    CRISPR-DR9:Estructura secundaria tomada de la base de datosRfamFamiliaRF01322.
  • CRISPR-DR19: Estructura secundaria tomada de la base de datos Rfam Familia RF01332.
    CRISPR-DR19:Estructura secundaria tomada de la base de datosRfamFamiliaRF01332.
  • CRISPR-DR41: Estructura secundaria tomada de la base de datos Rfam Familia RF01350.
    CRISPR-DR41:Estructura secundaria tomada de la base de datosRfamFamiliaRF01350.
  • CRISPR-DR52: Estructura secundaria tomada de la base de datos Rfam Familia RF01365.
    CRISPR-DR52:Estructura secundaria tomada de la base de datosRfamFamiliaRF01365.
  • CRISPR-DR57: Estructura secundaria tomada de la base de datos Rfam Familia RF01370.
    CRISPR-DR57:Estructura secundaria tomada de la base de datosRfamFamiliaRF01370.
  • CRISPR-DR65: Estructura secundaria tomada de la base de datos Rfam Familia RF01378.
    CRISPR-DR65:Estructura secundaria tomada de la base de datosRfamFamiliaRF01378.

Riesgos

[editar]

Segúninvestigadoresdel Instituto Wellcome Sanger enInglaterra,laedición genéticapuede llevar amutacionesno directamente relacionadas con el sitio de edición del genoma. La complejidad y la interrelación entre genes editados y no editados podría afectar a lasaluddepersonascon genes editados.[148]​ Estas mutaciones, al ser genéticas, pueden ser transmitidas a ladescendencia.En su monografíaEl fenotipo revolucionario(The revolutionary phenotype), elneurólogocanadienseJean-François Gariépydesarrolla unateoríabasada en laHipótesis del mundo de ARNen que la edición del genoma humano podría llegar a un reemplazo de lareproducción biológica.En lugar de la presente reproducción biológica, podría formarse una reproducción controlada porcientíficosusandoprogramas informáticospara cumplir los deseos de lospadreseligiendo una edición genética para sushijos.[149]​

Véase también

[editar]

Referencias

[editar]
  1. ↑abcHorvath, P.; Barrangou, R. (2010). «CRISPR/Cas, the Immune System of Bacteria and Archaea».Science327(5962): 167-170.PMID20056882.doi:10.1126/science.1179555.
  2. ↑«Flores, J. (2016, enero 5). Los orígenes bacterianos de la edición del genoma.La Jornada,sección Ciencias, p. 3a, suplementoLa Jornada de enmedio.México: DEMOS. (Consultado 6 de enero del 2016)».Consultado el 5 de abril de 2017.
  3. ↑abcMarraffini LA, Sontheimer EJ (March 2010).«CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea».Nature Reviews Genetics11(3): 181-190.PMC2928866.PMID20125085.doi:10.1038/nrg2749.
  4. ↑CRISPRdb 71/79 Archaea, 463/1008 BacteriaArchivadoel 16 de mayo de 2015 enWayback Machine., Date: 19.6.2010
  5. ↑abGrissa, I.; Vergnaud, G.; Pourcel, C (2007).«The CRISPRdb database and tools to display CRISPRs and to generate dictionaries of spacers and repeats».BMC Bioinformatics8:172.PMC1892036.PMID17521438.doi:10.1186/1471-2105-8-172.
  6. ↑Barrangou, R.; Fremaux, C.; Deveau, H.; Richards, M.; Boyaval, P.; Moineau, S.; Romero, D. A.; Horvath, P. (2007). «CRISPR Provides Acquired Resistance Against Viruses in Prokaryotes».Science315(5819): 1709-1712.PMID17379808.doi:10.1126/science.1138140.
  7. ↑abMarraffini LA, Sontheimer EJ. (2008).«CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA.».Science322(5909): 1843-5.PMID19095942.
  8. ↑Mali P, Esvelt KM, Church GM (2013).«Cas9 as a versatile tool for engineering biology».Nature methods10(10957-63).PMID24076990.
  9. ↑Kevin M Esvelt, Andrea L Smidler, Flaminia Catteruccia, George M Church (2014). «Concerning RNA-guided gene drives for the alteration of wild populations».eLife.doi:10.7554/eLife.03401.
  10. ↑Overballe-Petersen S, Harms K, Orlando LA, Mayar JV, Rasmussen S, Dahl TW, Rosing MT, Poole AM, Sicheritz-Ponten T, Brunak S, Inselmann S, de Vries J, Wackernagel W, Pybus OG, Nielsen R, Johnsen PJ, Nielsen KM, Willerslev E. (2013).«Bacterial natural transformation by highly fragmented and damaged DNA».Proc Natl Acad Sci U S A.110(49): 19860-5.
  11. ↑abhttp://jb.asm.org/content/169/12/5429.longNucleotide Sequence of the iap Gene, Responsible for Alkaline Phosphatase Isozyme Conversion in Escherichia coli, and Identification of the Gene Product
  12. ↑abcIshino Y, Shinagawa H, Makino K, Amemura M, Nakata A. (1987).«Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product.».J Bacteriol.169(12): 5429-33.
  13. ↑Mojica, F. J.; Juez, G.; Rodríguez-Valera, F. (1 de agosto de 1993).«Transcription at different salinities of Haloferax mediterranei sequences adjacent to partially modified PstI sites».Molecular Microbiology9(3): 613-621.ISSN0950-382X.PMID8412707.Consultado el 20 de enero de 2016.
  14. ↑Hermans, P. W.; van Soolingen, D.; Bik, E. M.; de Haas, P. E.; Dale, J. W.; van Embden, J. D. (1 de agosto de 1991).«Insertion element IS987 from Mycobacterium bovis BCG is located in a hot-spot integration region for insertion elements in Mycobacterium tuberculosis complex strains».Infection and Immunity59(8): 2695-2705.ISSN0019-9567.PMC258075.PMID1649798.Consultado el 20 de enero de 2016.
  15. ↑Groenen, P. M.; Bunschoten, A. E.; van Soolingen, D.; van Embden, J. D. (1 de diciembre de 1993).«Nature of DNA polymorphism in the direct repeat cluster of Mycobacterium tuberculosis; application for strain differentiation by a novel typing method».Molecular Microbiology10(5): 1057-1065.ISSN0950-382X.PMID7934856.Consultado el 20 de enero de 2016.
  16. ↑Mojica, F. J.; Ferrer, C.; Juez, G.; Rodríguez-Valera, F. (1 de julio de 1995).«Long stretches of short tandem repeats are present in the largest replicons of the Archaea Haloferax mediterranei and Haloferax volcanii and could be involved in replicon partitioning».Molecular Microbiology17(1): 85-93.ISSN0950-382X.PMID7476211.Consultado el 20 de enero de 2016.
  17. ↑Mojica FJ, Díez-Villaseñor C, Soria E, Juez G. (2000). «Biological significance of a family of regularly spaced repeats in the genomes of Archaea, Bacteria and mitochondria».Mol Microbiol36(1): 244-6.PMID10760181.
  18. ↑abJansen R, Embden JD, Gaastra W, Schouls LM (2002).«Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes».Mol Microbiol43(6): 1565-75.
  19. ↑abcdPourcel C, Salvignol G, Vergnaud G. (2005).«CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies».Microbiology151(Pt 3): 653-63.
  20. ↑abcBolotin A, Quinquis B, Sorokin A, Ehrlich SD (2005).«Clustered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacers of extrachromosomal origin».Microbiology151(Pt 8): 2551-61.
  21. ↑abMojica, Francisco J. M.; Díez-Villaseñor, César; García-Martínez, Jesús; Soria, Elena (1 de febrero de 2005).«Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements».Journal of Molecular Evolution60(2): 174-182.ISSN0022-2844.PMID15791728.doi:10.1007/s00239-004-0046-3.Consultado el 20 de enero de 2016.
  22. ↑abcdefghijkPennisi E (2013).«The CRISPR craze».Science341(6148): 833-6.
  23. ↑abJinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E (2012).«A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity».Science337(6096): 816-21.
  24. ↑«CRISPR gene therapy: Scientists call for more public debate around breakthrough technique - Science - News"».The Independent.7 de noviembre de 2013.
  25. ↑DiCarlo JE, Norville JE, Mali P, Rios X, Aach J, Church GM (2013).«Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems».Nucleic Acids Res41(7): 4336-43.
  26. ↑Hwang WY, Fu Y, Reyon D, Maeder ML, Tsai SQ, Sander JD, Peterson RT, Yeh JR, Joung JK (2013).«Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system».Nat Biotechnol31(3): 227-9.
  27. ↑Gratz SJ, Cummings AM, Nguyen JN, Hamm DC, Donohue LK, Harrison MM, Wildonger J, O'Connor-Giles KM (2013).«Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease».Genetics194(4): 1029-35.
  28. ↑Friedland AE, Tzur YB, Esvelt KM, Colaiácovo MP, Church GM, Calarco JA (2013).«Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system».Nat Methods10(8): 741-3.
  29. ↑Jiang W, Zhou H, Bi H, Fromm M, Yang B, Weeks DP (2013).«Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene modification in Arabidopsis, tobacco, sorghum and rice».Nucleic Acids Res41(20): e188.
  30. ↑abWang H, Yang H, Shivalila CS, Dawlaty MM, Cheng AW, Zhang F, Jaenisch R (2013).«One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering».Cell153(4): 910-8.
  31. ↑Larson MH, Gilbert LA, Wang X, Lim WA, Weissman JS, Qi LS (2013).«CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression».Nat Protoc8(11): 2180-96.
  32. ↑«Researchers reverse a liver disorder in mice by correcting a mutated gene».PhysOrg. 30 de marzo de 2014.Consultado el 31 de marzo de 2014.
  33. ↑Zetsche B; Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Slaymaker IM, Makarova KS, Essletzbichler P, Volz SE, Joung J, van der Oost J, Regev A, Koonin EV, Zhang F (October 2015). «Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system».Cell163(3): 759-71.PMID26422227.doi:10.1016/j.cell.2015.09.038.
  34. ↑Fonfara I; Richter H, Bratovič M, Le Rhun A, Charpentier E (April 2016). «The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA».Nature532(7600): 517-21.PMID27096362.doi:10.1038/nature17945.
  35. ↑Ewen-Campen, B.; Perrimon, N. (2020).Expanding the horizons of genome editing in the fruit fly with Cas12a117(39). pp. 24019-24021.doi:10.1073/pnas.2016446117.Consultado el 18 de enero de 2021.
  36. ↑Pausch, P.; Al-Shayeb, B.; Bisom-Rapp, E.; Tsuchida, C. A.; Li, Z.; Cress, B. F.;...; Doudna, J. A. (2020).CRISPR-CasΦ from huge phages is a hypercompact genome editor369(6501). pp. 333-337.doi:10.1126/science.abb1400.Consultado el 25 de enero de 2021.
  37. ↑Bosh, J. A.; Birchak, G.; Perrimon, N. (2020).Precise genome engineering in Drosophila using prime editing118(1).doi:10.1073/pnas.2021996118.Consultado el 25 de enero de 2021.
  38. ↑abcYoung, Susan (11 de febrero de 2014).«CRISPR and Other Genome Editing Tools Boost Medical Research and Gene Therapy’s Reach | MIT Technology Review».Technologyreview.com. Archivado desdeel originalel 12 de enero de 2016.Consultado el 13 de abril de 2014.
  39. ↑Shipman & al., Seth L. (12 de julio de 20147).«CRISPR–Cas encoding of a digital movie into the genomes of a population of living bacteria».Nature.Consultado el 16 de julio de 2017.
  40. ↑abcHaft DH, Selengut J, Mongodin EF, Nelson KE (2005).«A guild of 45 CRISPR-associated (Cas) protein families and multiple CRISPR/Cas subtypes exist in prokaryotic genomes».PLoS Comput Biol1(6): e60.
  41. ↑Stern A, Keren L, Wurtzel O, Amitai G, Sorek R (2010).«Self-targeting by CRISPR: gene regulation or autoimmunity?».Trends Genet26(8): 335-40.
  42. ↑abcTyson, Gene W.; Banfield, Jillian F. (1 de enero de 2008).«Rapidly evolving CRISPRs implicated in acquired resistance of microorganisms to viruses».Environmental Microbiology10(1): 200-207.ISSN1462-2920.PMID17894817.doi:10.1111/j.1462-2920.2007.01444.x.Consultado el 8 de agosto de 2016.
  43. ↑abcChylinski K, Makarova KS, Charpentier E, Koonin EV (2014).«Classification and evolution of type II CRISPR-Cas systems».Nucleic Acids Res42(10): 6091-105.
  44. ↑abcWiedenheft, B; Sternberg, SH; Doudna, JA (15 de febrero de 2012). «RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea.».Nature482(7385): 331-8.PMID22337052.
  45. ↑Sinkunas T, Gasiunas G, Fremaux C, Barrangou R, Horvath P, Siksnys V (2011).«Cas3 is a single-stranded DNA nuclease and ATP-dependent helicase in the CRISPR/Cas immune system».EMBO J30(7): 1335-42.
  46. ↑abcdAliyari R, Ding SW (2009).«RNA-based viral immunity initiated by the Dicer family of host immune receptors».Immunol Rev227(1): 176-88.
  47. ↑abMakarova KS, Aravind L, Wolf YI, Koonin EV (2011).Unification of Cas protein families and a simple scenario for the origin and evolution of CRISPR-Cas systems6.p. 38.
  48. ↑abcdGasiunas, Giedrius; Barrangou, Rodolphe; Horvath, Philippe; Siksnys, Virginijus (25 de septiembre de 2012).«Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria».Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America109(39): E2579-2586.ISSN1091-6490.PMC3465414.PMID22949671.doi:10.1073/pnas.1208507109.Consultado el 8 de agosto de 2016.
  49. ↑Chylinski K, Le Rhun A, Charpentier E (2013).«The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems».RNA Biol10(5): 726-37.
  50. ↑abDugar, Gaurav; Herbig, Alexander; Förstner, Konrad U.; Heidrich, Nadja; Reinhardt, Richard; Nieselt, Kay; Sharma, Cynthia M. (1 de mayo de 2013).«High-resolution transcriptome maps reveal strain-specific regulatory features of multiple Campylobacter jejuni isolates».PLoS genetics9(5): e1003495.ISSN1553-7404.PMC3656092.PMID23696746.doi:10.1371/journal.pgen.1003495.Consultado el 8 de agosto de 2016.
  51. ↑Hatoum-Aslan, Asma; Maniv, Inbal; Marraffini, Luciano A. (27 de diciembre de 2011).«Mature clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats RNA (crRNA) length is measured by a ruler mechanism anchored at the precursor processing site».Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America108(52): 21218-21222.ISSN1091-6490.PMC3248500.PMID22160698.doi:10.1073/pnas.1112832108.Consultado el 20 de mayo de 2016.
  52. ↑abYosef, Ido; Goren, Moran G.; Qimron, Udi (1 de julio de 2012).«Proteins and DNA elements essential for the CRISPR adaptation process in Escherichia coli».Nucleic Acids Research40(12): 5569-5576.ISSN1362-4962.PMC3384332.PMID22402487.doi:10.1093/nar/gks216.Consultado el 8 de agosto de 2016.
  53. ↑abcdSwarts, Daan C.; Mosterd, Cas; van Passel, Mark W. J.; Brouns, Stan J. J. (1 de enero de 2012).«CRISPR interference directs strand specific spacer acquisition».PloS One7(4): e35888.ISSN1932-6203.PMC3338789.PMID22558257.doi:10.1371/journal.pone.0035888.Consultado el 8 de agosto de 2016.
  54. ↑Babu, Mohan; Beloglazova, Natalia; Flick, Robert; Graham, Chris; Skarina, Tatiana; Nocek, Boguslaw; Gagarinova, Alla; Pogoutse, Oxanaet al.(1 de enero de 2011).«A dual function of the CRISPR-Cas system in bacterial antivirus immunity and DNA repair».Molecular Microbiology79(2): 484-502.ISSN1365-2958.PMC3071548.PMID21219465.doi:10.1111/j.1365-2958.2010.07465.x.Consultado el 20 de mayo de 2016.Babu, Mohan; Beloglazova, Natalia; Flick, Robert; Graham, Chris; Skarina, Tatiana; Nocek, Boguslaw; Gagarinova, Alla; Pogoutse, Oxanaet al.(1 de enero de 2011).«A dual function of the CRISPR-Cas system in bacterial antivirus immunity and DNA repair».Molecular Microbiology79(2): 484-502.ISSN1365-2958.PMC3071548.PMID21219465.doi:10.1111/j.1365-2958.2010.07465.x.Consultado el 20 de mayo de 2016.
  55. ↑Han, Dong; Lehmann, Kathleen; Krauss, Gerhard (18 de junio de 2009).«SSO1450--a CAS1 protein from Sulfolobus solfataricus P2 with high affinity for RNA and DNA».FEBS letters583(12): 1928-1932.ISSN1873-3468.PMID19427858.doi:10.1016/j.febslet.2009.04.047.Consultado el 20 de mayo de 2016.
  56. ↑Wiedenheft, Blake; Zhou, Kaihong; Jinek, Martin; Coyle, Scott M.; Ma, Wendy; Doudna, Jennifer A. (10 de junio de 2009).«Structural basis for DNase activity of a conserved protein implicated in CRISPR-mediated genome defense».Structure (London, England: 1993)17(6): 904-912.ISSN1878-4186.PMID19523907.doi:10.1016/j.str.2009.03.019.Consultado el 20 de mayo de 2016.
  57. ↑Beloglazova, Natalia; Brown, Greg; Zimmerman, Matthew D.; Proudfoot, Michael; Makarova, Kira S.; Kudritska, Marina; Kochinyan, Samvel; Wang, Shurenet al.(18 de julio de 2008).«A novel family of sequence-specific endoribonucleases associated with the clustered regularly interspaced short palindromic repeats».The Journal of Biological Chemistry283(29): 20361-20371.ISSN0021-9258.PMC2459268.PMID18482976.doi:10.1074/jbc.M803225200.Consultado el 20 de mayo de 2016.
  58. ↑Samai, Poulami; Smith, Paul; Shuman, Stewart (1 de diciembre de 2010).«Structure of a CRISPR-associated protein Cas2 from Desulfovibrio vulgaris».Acta Crystallographica. Section F, Structural Biology and Crystallization Communications66(Pt 12): 1552-1556.ISSN1744-3091.PMC2998353.PMID21139194.doi:10.1107/S1744309110039801.Consultado el 20 de mayo de 2016.
  59. ↑Nam, Ki Hyun; Ding, Fran; Haitjema, Charles; Huang, Qingqiu; DeLisa, Matthew P.; Ke, Ailong (19 de octubre de 2012).«Double-stranded endonuclease activity in Bacillus halodurans clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated Cas2 protein».The Journal of Biological Chemistry287(43): 35943-35952.ISSN1083-351X.PMC3476262.PMID22942283.doi:10.1074/jbc.M112.382598.Consultado el 20 de mayo de 2016.
  60. ↑abMojica, F. J. M.; Díez-Villaseñor, C.; García-Martínez, J.; Almendros, C. (1 de marzo de 2009).«Short motif sequences determine the targets of the prokaryotic CRISPR defence system».Microbiology (Reading, England)155(Pt 3): 733-740.ISSN1350-0872.PMID19246744.doi:10.1099/mic.0.023960-0.Consultado el 20 de enero de 2016.
  61. ↑abcdHorvath, Philippe; Romero, Dennis A.; Coûté-Monvoisin, Anne-Claire; Richards, Melissa; Deveau, Hélène; Moineau, Sylvain; Boyaval, Patrick; Fremaux, Christopheet al.(1 de febrero de 2008).«Diversity, activity, and evolution of CRISPR loci in Streptococcus thermophilus».Journal of Bacteriology190(4): 1401-1412.ISSN1098-5530.PMC2238196.PMID18065539.doi:10.1128/JB.01415-07.Consultado el 8 de agosto de 2016.
  62. ↑abcDeveau, Hélène; Barrangou, Rodolphe; Garneau, Josiane E.; Labonté, Jessica; Fremaux, Christophe; Boyaval, Patrick; Romero, Dennis A.; Horvath, Philippeet al.(1 de febrero de 2008).«Phage response to CRISPR-encoded resistance in Streptococcus thermophilus».Journal of Bacteriology190(4): 1390-1400.ISSN1098-5530.PMC2238228.PMID18065545.doi:10.1128/JB.01412-07.Consultado el 8 de agosto de 2016.
  63. ↑abLillestøl, Reidun K.; Shah, Shiraz A.; Brügger, Kim; Redder, Peter; Phan, Hien; Christiansen, Jan; Garrett, Roger A. (1 de abril de 2009).«CRISPR families of the crenarchaeal genus Sulfolobus: bidirectional transcription and dynamic properties».Molecular Microbiology72(1): 259-272.ISSN1365-2958.PMID19239620.doi:10.1111/j.1365-2958.2009.06641.x.Consultado el 8 de agosto de 2016.
  64. ↑abShah SA, Hansen NR, Garrett RA (2009).«Distribution of CRISPR spacer matches in viruses and plasmids of crenarchaeal acidothermophiles and implications for their inhibitory mechanism».Biochem Soc Trans37(Pt 1): 23-8.
  65. ↑abDíez-Villaseñor, César; Guzmán, Noemí M.; Almendros, Cristóbal; García-Martínez, Jesús; Mojica, Francisco J. M. (1 de mayo de 2013).«CRISPR-spacer integration reporter plasmids reveal distinct genuine acquisition specificities among CRISPR-Cas I-E variants of Escherichia coli».RNA biology10(5): 792-802.ISSN1555-8584.PMC3737337.PMID23445770.doi:10.4161/rna.24023.Consultado el 8 de agosto de 2016.
  66. ↑abcErdmann, Susanne; Garrett, Roger A. (1 de septiembre de 2012).«Selective and hyperactive uptake of foreign DNA by adaptive immune systems of an archaeon via two distinct mechanisms».Molecular Microbiology85(6): 1044-1056.ISSN1365-2958.PMC3468723.PMID22834906.doi:10.1111/j.1365-2958.2012.08171.x.Consultado el 8 de agosto de 2016.
  67. ↑abShah, Shiraz A.; Erdmann, Susanne; Mojica, Francisco J. M.; Garrett, Roger A. (1 de mayo de 2013).«Protospacer recognition motifs: mixed identities and functional diversity».RNA biology10(5): 891-899.ISSN1555-8584.PMC3737346.PMID23403393.doi:10.4161/rna.23764.Consultado el 8 de agosto de 2016.
  68. ↑Andersson, Anders F.; Banfield, Jillian F. (23 de mayo de 2008).«Virus population dynamics and acquired virus resistance in natural microbial communities».Science (New York, N.Y.)320(5879): 1047-1050.ISSN1095-9203.PMID18497291.doi:10.1126/science.1157358.Consultado el 20 de mayo de 2016.
  69. ↑abcdPride, David T.; Sun, Christine L.; Salzman, Julia; Rao, Nitya; Loomer, Peter; Armitage, Gary C.; Banfield, Jillian F.; Relman, David A. (1 de enero de 2011).«Analysis of streptococcal CRISPRs from human saliva reveals substantial sequence diversity within and between subjects over time».Genome Research21(1): 126-136.ISSN1549-5469.PMC3012920.PMID21149389.doi:10.1101/gr.111732.110.Consultado el 8 de agosto de 2016.
  70. ↑abGoren, Moran G.; Yosef, Ido; Auster, Oren; Qimron, Udi (12 de octubre de 2012).«Experimental definition of a clustered regularly interspaced short palindromic duplicon in Escherichia coli».Journal of Molecular Biology423(1): 14-16.ISSN1089-8638.PMID22771574.doi:10.1016/j.jmb.2012.06.037.Consultado el 8 de agosto de 2016.
  71. ↑abcDatsenko, Kirill A.; Pougach, Ksenia; Tikhonov, Anton; Wanner, Barry L.; Severinov, Konstantin; Semenova, Ekaterina (1 de enero de 2012).«Molecular memory of prior infections activates the CRISPR/Cas adaptive bacterial immunity system».Nature Communications3:945.ISSN2041-1723.PMID22781758.doi:10.1038/ncomms1937.Consultado el 8 de agosto de 2016.
  72. ↑Tang, TH; Bachellerie, JP; Rozhdestvensky, T; Bortolin, ML; Huber, H; Drungowski, M; Elge, T; Brosius, Jet al.(28 de mayo de 2002). «Identification of 86 candidates for small non-messenger RNAs from the archaeon Archaeoglobus fulgidus.».Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America99(11): 7536-41.PMID12032318.
  73. ↑Tang, TH; Polacek, N; Zywicki, M; Huber, H; Brugger, K; Garrett, R; Bachellerie, JP; Hüttenhofer, A (de enero de 2005). «Identification of novel non-coding RNAs as potential antisense regulators in the archaeon Sulfolobus solfataricus.».Molecular microbiology55(2): 469-81.PMID15659164.
  74. ↑Gesner, EM; Schellenberg, MJ; Garside, EL; George, MM; Macmillan, AM (de junio de 2011). «Recognition and maturation of effector RNAs in a CRISPR interference pathway.».Nature structural & molecular biology18(6): 688-92.PMID21572444.
  75. ↑Sashital, DG; Jinek, M; Doudna, JA (de junio de 2011). «An RNA-induced conformational change required for CRISPR RNA cleavage by the endoribonuclease Cse3.».Nature structural & molecular biology18(6): 680-7.PMID21572442.
  76. ↑Haurwitz, RE; Jinek, M; Wiedenheft, B; Zhou, K; Doudna, JA (10 de septiembre de 2010). «Sequence- and structure-specific RNA processing by a CRISPR endonuclease.».Science (New York, N.Y.)329(5997): 1355-8.PMID20829488.
  77. ↑abcKunin, Victor; Sorek, Rotem; Hugenholtz, Philip (1 de enero de 2007).«Evolutionary conservation of sequence and secondary structures in CRISPR repeats».Genome Biology8(4): R61.ISSN1474-760X.PMC1896005.PMID17442114.doi:10.1186/gb-2007-8-4-r61.Consultado el 8 de agosto de 2016.
  78. ↑Carte, J; Wang, R; Li, H; Terns, RM; Terns, MP (15 de diciembre de 2008). «Cas6 is an endoribonuclease that generates guide RNAs for invader defense in prokaryotes.».Genes & development22(24): 3489-96.PMID19141480.
  79. ↑Wang, R; Preamplume, G; Terns, MP; Terns, RM; Li, H (9 de febrero de 2011). «Interaction of the Cas6 riboendonuclease with CRISPR RNAs: recognition and cleavage.».Structure (London, England: 1993)19(2): 257-64.PMID21300293.
  80. ↑Niewoehner, O; Jinek, M; Doudna, JA (de enero de 2014). «Evolution of CRISPR RNA recognition and processing by Cas6 endonucleases.».Nucleic acids research42(2): 1341-53.PMID24150936.
  81. ↑Garneau, JE; Dupuis, MÈ; Villion, M; Romero, DA; Barrangou, R; Boyaval, P; Fremaux, C; Horvath, P; Magadán, AH; Moineau, S (4 de noviembre de 2010). «The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA.».Nature468(7320): 67-71.PMID21048762.
  82. ↑Semenova, E; Jore, MM; Datsenko, KA; Semenova, A; Westra, ER; Wanner, B; van der Oost, J; Brouns, SJet al.(21 de junio de 2011). «Interference by clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) RNA is governed by a seed sequence.».Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America108(25): 10098-103.PMID21646539.
  83. ↑Gudbergsdottir, S; Deng, L; Chen, Z; Jensen, JV; Jensen, LR; She, Q; Garrett, RA (de enero de 2011). «Dynamic properties of the Sulfolobus CRISPR/Cas and CRISPR/Cmr systems when challenged with vector-borne viral and plasmid genes and protospacers.».Molecular microbiology79(1): 35-49.PMID21166892.
  84. ↑Manica, A; Zebec, Z; Teichmann, D; Schleper, C (de abril de 2011). «In vivo activity of CRISPR-mediated virus defence in a hyperthermophilic archaeon.».Molecular microbiology80(2): 481-91.PMID21385233.
  85. ↑Jore, MM; Lundgren, M; van Duijn, E; Bultema, JB; Westra, ER; Waghmare, SP; Wiedenheft, B; Pul, U; Wurm, R; Wagner, R; Beijer, MR; Barendregt, A; Zhou, K; Snijders, AP; Dickman, MJ; Doudna, JA; Boekema, EJ; Heck, AJ; van der Oost, J; Brouns, SJ (de mayo de 2011). «Structural basis for CRISPR RNA-guided DNA recognition by Cascade.».Nature structural & molecular biology18(5): 529-36.PMID21460843.
  86. ↑Wiedenheft, B; Lander, GC; Zhou, K; Jore, MM; Brouns, SJ; van der Oost, J; Doudna, JA; Nogales, E (21 de septiembre de 2011). «Structures of the RNA-guided surveillance complex from a bacterial immune system.».Nature477(7365): 486-9.PMID21938068.
  87. ↑Zhang, J; Rouillon, C; Kerou, M; Reeks, J; Brugger, K; Graham, S; Reimann, J; Cannone, G; Liu, H; Albers, SV; Naismith, JH; Spagnolo, L; White, MF (10 de febrero de 2012). «Structure and mechanism of the CMR complex for CRISPR-mediated antiviral immunity.».Molecular cell45(3): 303-13.PMID22227115.
  88. ↑abHale, Caryn R.; Zhao, Peng; Olson, Sara; Duff, Michael O.; Graveley, Brenton R.; Wells, Lance; Terns, Rebecca M.; Terns, Michael P. (25 de noviembre de 2009).«RNA-guided RNA cleavage by a CRISPR RNA-Cas protein complex».Cell139(5): 945-956.ISSN1097-4172.PMC2951265.PMID19945378.doi:10.1016/j.cell.2009.07.040.Consultado el 8 de agosto de 2016.
  89. ↑Deng, Ling; Garrett, Roger A.; Shah, Shiraz A.; Peng, Xu; She, Qunxin (1 de marzo de 2013).«A novel interference mechanism by a type IIIB CRISPR-Cmr module in Sulfolobus».Molecular Microbiology87(5): 1088-1099.ISSN1365-2958.PMID23320564.doi:10.1111/mmi.12152.Consultado el 8 de agosto de 2016.
  90. ↑abcMarraffini, Luciano A.; Sontheimer, Erik J. (28 de enero de 2010).«Self versus non-self discrimination during CRISPR RNA-directed immunity».Nature463(7280): 568-571.ISSN1476-4687.PMC2813891.PMID20072129.doi:10.1038/nature08703.Consultado el 8 de agosto de 2016.
  91. ↑Kellie, Shaefer (29 de mayo de 2017).«Unexpected mutations after CRISPR–Cas9 editing in vivo».Nature Methods.Consultado el 30 de julio de 2017.
  92. ↑Derek, Lowe (31 de mayo de 2017).«Trouble with CRISPR? Maybe, But Maybe Not».Science.Archivado desdeel originalel 29 de julio de 2017.Consultado el 30 de julio de 2017.
  93. ↑Whole-Genome Sequencing Analysis Reveals High Specificity of CRISPR/Cas9 and TALEN-Based Genome Editing in Human iPSCs.
  94. ↑Digenome-seq: genome-wide profiling of CRISPR-Cas9 off-target effects in human cells.
  95. ↑«Targeted and genome-wide sequencing reveal single nucleotide variations impacting specificity of Cas9 in human stem cells».
  96. ↑Suh, Yousin (14 de diciembre de 2017).«Faculty of 1000 evaluation for CIRCLE-seq: a highly sensitive in vitro screen for genome-wide CRISPR-Cas9 nuclease off-targets.».F1000 - Post-publication peer review of the biomedical literature.Consultado el 6 de enero de 2019.
  97. ↑Joung, J. Keith; Maresca, Marcello; Aryee, Martin J.; Bohlooly-Y, Mohammad; Pinello, Luca; Mayr, Lorenz M.; Nitsch, Roberto; Nguyen, Nhu T.et al.(2018-09).«In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations».Nature(en inglés)561(7723): 416-419.ISSN1476-4687.PMC6194229.PMID30209390.doi:10.1038/s41586-018-0500-9.Consultado el 6 de enero de 2019.
  98. ↑Touchon, Marie; Rocha, Eduardo P. C. (1 de enero de 2010).«The small, slow and specialized CRISPR and anti-CRISPR of Escherichia and Salmonella».PloS One5(6): e11126.ISSN1932-6203.PMC2886076.PMID20559554.doi:10.1371/journal.pone.0011126.Consultado el 8 de agosto de 2016.
  99. ↑abcRho, Mina; Wu, Yu-Wei; Tang, Haixu; Doak, Thomas G.; Ye, Yuzhen (1 de enero de 2012).«Diverse CRISPRs evolving in human microbiomes».PLoS genetics8(6): e1002441.ISSN1553-7404.PMC3374615.PMID22719260.doi:10.1371/journal.pgen.1002441.Consultado el 8 de agosto de 2016.
  100. ↑abSun, Christine L.; Barrangou, Rodolphe; Thomas, Brian C.; Horvath, Philippe; Fremaux, Christophe; Banfield, Jillian F. (1 de febrero de 2013).«Phage mutations in response to CRISPR diversification in a bacterial population».Environmental Microbiology15(2): 463-470.ISSN1462-2920.PMID23057534.doi:10.1111/j.1462-2920.2012.02879.x.Consultado el 8 de agosto de 2016.
  101. ↑Kuno, Sotaro; Sako, Yoshihiko; Yoshida, Takashi (1 de mayo de 2014).«Diversification of CRISPR within coexisting genotypes in a natural population of the bloom-forming cyanobacterium Microcystis aeruginosa».Microbiology (Reading, England)160(Pt 5): 903-916.ISSN1465-2080.PMID24586036.doi:10.1099/mic.0.073494-0.Consultado el 8 de agosto de 2016.
  102. ↑Bland, Charles; Ramsey, Teresa L.; Sabree, Fareedah; Lowe, Micheal; Brown, Kyndall; Kyrpides, Nikos C.; Hugenholtz, Philip (1 de enero de 2007).«CRISPR recognition tool (CRT): a tool for automatic detection of clustered regularly interspaced palindromic repeats».BMC bioinformatics8:209.ISSN1471-2105.PMC1924867.PMID17577412.doi:10.1186/1471-2105-8-209.Consultado el 8 de agosto de 2016.
  103. ↑Edgar, Robert C. (1 de enero de 2007).«PILER-CR: fast and accurate identification of CRISPR repeats».BMC bioinformatics8:18.ISSN1471-2105.PMC1790904.PMID17239253.doi:10.1186/1471-2105-8-18.Consultado el 8 de agosto de 2016.
  104. ↑Grissa, Ibtissem; Vergnaud, Gilles; Pourcel, Christine (1 de julio de 2007).«CRISPRFinder: a web tool to identify clustered regularly interspaced short palindromic repeats».Nucleic Acids Research35(Web Server issue): W52-57.ISSN1362-4962.PMC1933234.PMID17537822.doi:10.1093/nar/gkm360.Consultado el 8 de agosto de 2016.
  105. ↑Pride, David T.; Salzman, Julia; Relman, David A. (1 de septiembre de 2012).«Comparisons of clustered regularly interspaced short palindromic repeats and viromes in human saliva reveal bacterial adaptations to salivary viruses».Environmental Microbiology14(9): 2564-2576.ISSN1462-2920.PMC3424356.PMID22583485.doi:10.1111/j.1462-2920.2012.02775.x.Consultado el 8 de agosto de 2016.
  106. ↑Held, Nicole L.; Herrera, Alfa; Whitaker, Rachel J. (1 de noviembre de 2013).«Reassortment of CRISPR repeat-spacer loci in Sulfolobus islandicus».Environmental Microbiology15(11): 3065-3076.ISSN1462-2920.PMID23701169.doi:10.1111/1462-2920.12146.Consultado el 8 de agosto de 2016.
  107. ↑Held, Nicole L.; Herrera, Alfa; Cadillo-Quiroz, Hinsby; Whitaker, Rachel J. (1 de enero de 2010).«CRISPR associated diversity within a population of Sulfolobus islandicus».PloS One5(9).ISSN1932-6203.PMC2946923.PMID20927396.doi:10.1371/journal.pone.0012988.Consultado el 8 de agosto de 2016.
  108. ↑Skennerton, Connor T.; Imelfort, Michael; Tyson, Gene W. (1 de mayo de 2013).«Crass: identification and reconstruction of CRISPR from unassembled metagenomic data».Nucleic Acids Research41(10): e105.ISSN1362-4962.PMC3664793.PMID23511966.doi:10.1093/nar/gkt183.Consultado el 8 de agosto de 2016.
  109. ↑Koonin, Eugene V.; Wolf, Yuri I. (1 de enero de 2009).«Is evolution Darwinian or/and Lamarckian?».Biology Direct4:42.ISSN1745-6150.PMC2781790.PMID19906303.doi:10.1186/1745-6150-4-42.Consultado el 8 de agosto de 2016.
  110. ↑Heidelberg, John F.; Nelson, William C.; Schoenfeld, Thomas; Bhaya, Devaki (1 de enero de 2009).«Germ warfare in a microbial mat community: CRISPRs provide insights into the co-evolution of host and viral genomes».PloS One4(1): e4169.ISSN1932-6203.PMC2612747.PMID19132092.doi:10.1371/journal.pone.0004169.Consultado el 8 de agosto de 2016.
  111. ↑Sampson, Timothy R.; Saroj, Sunil D.; Llewellyn, Anna C.; Tzeng, Yih-Ling; Weiss, David S. (9 de mayo de 2013).«A CRISPR/Cas system mediates bacterial innate immune evasion and virulence».Nature497(7448): 254-257.ISSN1476-4687.PMC3651764.PMID23584588.doi:10.1038/nature12048.Consultado el 8 de agosto de 2016.
  112. ↑Hale, Caryn R.; Majumdar, Sonali; Elmore, Joshua; Pfister, Neil; Compton, Mark; Olson, Sara; Resch, Alissa M.; Glover, Claiborne V. C.; Graveley, Brenton R.; Terns, Rebecca M.; Terns, Michael P. (10 de febrero de 2012).«Essential features and rational design of CRISPR RNAs that function with the Cas RAMP module complex to cleave RNAs».Molecular Cell45(3): 292-302.ISSN1097-4164.PMC3278580.PMID22227116.doi:10.1016/j.molcel.2011.10.023.Consultado el 8 de agosto de 2016.
  113. ↑Sorek, Rotem; Kunin, Victor; Hugenholtz, Philip (1 de marzo de 2008).«CRISPR--a widespread system that provides acquired resistance against phages in bacteria and archaea».Nature Reviews. Microbiology6(3): 181-186.ISSN1740-1534.PMID18157154.doi:10.1038/nrmicro1793.Consultado el 8 de agosto de 2016.
  114. ↑Cong, Le; Ran, F. Ann; Cox, David; Lin, Shuailiang; Barretto, Robert; Habib, Naomi; Hsu, Patrick D.; Wu, Xuebing; Jiang, Wenyan; Marraffini, Luciano A.; Zhang, Feng (15 de febrero de 2013).«Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems».Science (New York, N.Y.)339(6121): 819-823.ISSN1095-9203.PMC3795411.PMID23287718.doi:10.1126/science.1231143.Consultado el 8 de agosto de 2016.
  115. ↑Mali, Prashant; Yang, Luhan; Esvelt, Kevin M.; Aach, John; Guell, Marc; DiCarlo, James E.; Norville, Julie E.; Church, George M. (15 de febrero de 2013).«RNA-guided human genome engineering via Cas9».Science (New York, N.Y.)339(6121): 823-826.ISSN1095-9203.PMC3712628.PMID23287722.doi:10.1126/science.1232033.Consultado el 8 de agosto de 2016.
  116. ↑Hou Z, Zhang Y, Propson N, Howden S, Chu L, Sontheimer E et al (2013). «Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis».Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America110(39): 15644.doi:10.1073/pnas.1313587110.
  117. ↑abYoung, Susan.«Biotech Startup Editas Medicine Wants to Cure Grievous Genetic Diseases with New Genome Editing Technology | MIT Technology Review».Technologyreview.com. Archivado desdeel originalel 6 de octubre de 2015.Consultado el 30 de noviembre de 2013.
  118. ↑«Seamless gene correction of β-thalassemia mutations in patient-specific iPSCs using CRISPR/Cas9 and piggyBac».
  119. ↑Eides, Rachel (12 de junio de 2020).«CRISPR Therapeutics and Vertex Announce New Clinical Data for Investigational Gene-Editing Therapy CTX001™ in Severe Hemoglobinopathies at the 25th Annual European Hematology Association (EHA) Congress».Consultado el 21 de junio de 2020.
  120. ↑Silva, Joana Cavaco (13 de mayo de 2020).«CTX001».Consultado el 24 de junio de 2020.
  121. ↑«Científicos chinos aseguran haber creado los primeros bebés modificados genéticamente».El Pais.noviembre de 2018.
  122. ↑Arthur Caplan (30 de abril de 2019).«Getting serious about the challenge of regulating germline gene therapy».PLOS Biology17(4): e3000223.doi:10.1371/journal.pbio.3000223.
  123. ↑Haoyi Wang; Hui Yang (30 de abril de 2019).«Gene-edited babies: What went wrong and what could go wrong».PLOS Biology17(4): e3000224.doi:10.1371/journal.pbio.3000224.
  124. ↑Talbot, David (19 de julio de 2014).«Beijing Researchers Use Gene Editing to Create Disease-Resistant Wheat | MIT Technology Review».Technologyreview.com.Consultado el 23 de julio de 2014.
  125. ↑Wang, Yanpeng (2014). «Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance to powdery mildew».Nature Biotechnology.doi:10.1038/nbt.2969.
  126. ↑Chang, Jiasong, et al. "Genome-wide CRISPR Screening Reveals Genes Essential for Cell Viability and Resistance to Abiotic and Biotic Stresses in Bombyx Mori."Genome Research,vol. 30, no. 5, 2020, pp. 757-767.
  127. ↑ENCODE Project Consortium (6 de septiembre de 2012).«An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome».Nature489(7414): 57-74.ISSN1476-4687.PMC3439153.PMID22955616.doi:10.1038/nature11247.Consultado el 18 de febrero de 2017.
  128. ↑Melnikov, Alexandre; Murugan, Anand; Zhang, Xiaolan; Tesileanu, Tiberiu; Wang, Li; Rogov, Peter; Feizi, Soheil; Gnirke, Andreaset al..«Systematic dissection and optimization of inducible enhancers in human cells using a massively parallel reporter assay».Nature Biotechnology30(3): 271-277.PMC3297981.PMID22371084.doi:10.1038/nbt.2137.
  129. ↑«Targeting the Noncoding Genome with CRISPR».29 de septiembre de 2016.
  130. ↑Sanjana, Neville E.; Wright, Jason; Zheng, Kaijie; Shalem, Ophir; Fontanillas, Pierre; Joung, Julia; Cheng, Christine; Regev, Avivet al.(30 de septiembre de 2016).«High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome».Science(en inglés)353(6307): 1545-1549.ISSN0036-8075.PMC5144102.PMID27708104.doi:10.1126/science.aaf7613.Consultado el 18 de febrero de 2017.
  131. ↑V600E
  132. ↑Akbani, Rehan; Akdemir, Kadir C.; Aksoy, B. Arman; Albert, Monique; Ally, Adrian; Amin, Samirkumar B.; Arachchi, Harindra; Arora, Arshiet al..«Genomic Classification of Cutaneous Melanoma».Cell161(7): 1681-1696.PMC4580370.PMID26091043.doi:10.1016/j.cell.2015.05.044.
  133. ↑Sosman, Jeffrey A.; Kim, Kevin B.; Schuchter, Lynn; Gonzalez, Rene; Pavlick, Anna C.; Weber, Jeffrey S.; McArthur, Grant A.; Hutson, Thomas E.et al.(23 de febrero de 2012).«Survival in BRAF V600–Mutant Advanced Melanoma Treated with Vemurafenib».New England Journal of Medicine366(8): 707-714.ISSN0028-4793.PMC3724515.PMID22356324.doi:10.1056/NEJMoa1112302.Consultado el 18 de febrero de 2017.
  134. ↑Zubrilov, Inna; Sagi-Assif, Orit; Izraely, Sivan; Meshel, Tsipi; Ben-Menahem, Shlomit; Ginat, Ravit; Pasmanik-Chor, Metsada; Nahmias, Claraet al..«Vemurafenib resistance selects for highly malignant brain and lung-metastasizing melanoma cells».Cancer Letters361(1): 86-96.doi:10.1016/j.canlet.2015.02.041.
  135. ↑Shalem, Ophir; Sanjana, Neville E.; Hartenian, Ella; Shi, Xi; Scott, David A.; Mikkelsen, Tarjei S.; Heckl, Dirk; Ebert, Benjamin L.et al.(3 de enero de 2014).«Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells».Science(en inglés)343(6166): 84-87.ISSN0036-8075.PMC4089965.PMID24336571.doi:10.1126/science.1247005.Consultado el 18 de febrero de 2017.
  136. ↑Novick, Richard P.; Christie, Gail E.; Penadés, Jose R. (1 de agosto de 2010).«The phage-related chromosomal islands of Gram-positive bacteria».Nature Reviews. Microbiology8(8): 541-551.ISSN1740-1534.PMC3522866.PMID20634809.doi:10.1038/nrmicro2393.Consultado el 8 de agosto de 2016.
  137. ↑Seed, Kimberley D.; Lazinski, David W.; Calderwood, Stephen B.; Camilli, Andrew (28 de febrero de 2013).«A bacteriophage encodes its own CRISPR/Cas adaptive response to evade host innate immunity».Nature494(7438): 489-491.ISSN1476-4687.PMC3587790.PMID23446421.doi:10.1038/nature11927.Consultado el 8 de agosto de 2016.
  138. ↑«Who Owns the Biggest Biotech Discovery of the Century? There’s a bitter fight over the patents for CRISPR, a breakthrough new form of DNA editing.».MITTechnology Review.Archivado desdeel originalel 17 de noviembre de 2015.Consultado el 25 de febrero de 2015.«CRISPR Patents Spark Fight to Control Genome Editing».
  139. ↑«Methods And Compositions For Rna-directed Target Dna Modification And For Rna-directed Modulation Of Transcription».Freshpatents.com. Archivado desdeel originalel 7 de abril de 2014.Consultado el 13 de abril de 2014.
  140. ↑abWho Owns the Biggest Biotech Discovery of the Century?Archivadoel 17 de noviembre de 2015 enWayback Machine.Antonio Regalado,Technology Review,04 December 2014.
  141. ↑Pollack, Andrew (15 de febrero de 2017).«Harvard and M.I.T. Scientists Win Gene-Editing Patent Fight».The New York Times.
  142. ↑Akst, Jef (15 de febrero de 2017).«Broad Wins CRISPR Patent Interference Case».The Scientist Magazine.
  143. ↑Noonan, Kevin E. (16 de febrero de 2017).«PTAB Decides CRISPR Interference in Favor of Broad Institute -- Their Reasoning».Patent Docs.
  144. ↑«CRISPR Madness».GEN.
  145. ↑Staff (1 de abril de 2015). «News: Products & Services».Genetic Engineering & Biotechnology News(Paper)35(7): 8.
  146. ↑http://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(15)01705-5The Heroes of CRISPR
  147. ↑«http://www.agenciasinc.es/Entrevistas/Estoy-viviendo-la-revolucion-CRISPR-con-agobio-y-felicidad».Consultado el 5 de abril de 2017.
  148. ↑Alejandra Martins (2018).«CRISPR/Cas9: las serias advertencias de unos científicos sobre los peligros de la técnica que revolucionó la genética».
  149. ↑Jean-François Gariépy (2018).The revolutionary phenotype(en inglés).p. 92–95.ISBN9781729861561.
Obtenido de «https://es.wikipedia.org/w/index.php?title=CRISPR&oldid=162851942»