siRNA

RNA התערבותי קטן(siRNA), המכונה לעיתיםRNA התערבותי קצראומשתיק RNAהוא סוג שלמולקולת RNA דו גדילי,20-25זוגות בסיסיםבאורכו. siRNA ממלא תפקידים רבים, אבל בולט ביותר במסלול ההפרעה ל-RNAi) RNA), שבו הוא מפריע לביטוי של גניםספציפיים עם רצףנוקליאוטידיםמשלים. siRNA פועל גם במסלולים הקשורים ל-RNAi, למשל, כמנגנון נגיפי או בעיצוב מבנה הכרומטיןשל הגנום.המורכבות של המסלולים האלה נחקרת ומתגלת רק בזמן האחרון.

siRNA ותפקידם בהשתקת גניםלאחר תעתיק (PTGS) בצמחים נתגלה לראשונה על ידי הצוות שלדייוויד פאולקומבבמעבדת סנסבורי בנוריץ',אנגליהודווחו ב-Scienceבשנת 1999.^[1]תומאס תסקלועמיתיו דיווחו ב-Natureכי siRNA מלאכותי יכול לגרום ל-RNAi בתאייונקים.^[2]גילוי זה הוביל לפריצת דרך בעניין רתימת RNAi למחקר ביורפואי ופיתוח תרופות.

מבנה

יש ל-siRNA מבנה מוגדר היטב: RNA קצר (בדרך כלל 20–24 זוג בסיסים) דו-גדילי (dsRNA) עםזרחוןשל קצוות 5' והידרוקסילציהשל קצוות 3' ושני נוקלאוטידים בולטים.אנזיםהדייסר(Dicer) מזרז ייצור של siRNA מ-RNAדו-גדילי ארוך (dsRNA).^[3]מאחר שבאופן עקרוני siRNA מלאכותי עם רצף משלים יכול להשתיק כל גן, הוא נחשב לכלי חשוב לאימות תפקוד הגן ולמיקוד תרופות.

תפקיד siRNA ב-RNAi

לעיתיםטרנספקציהשל siRNA אקסוגני במטרה לגרום להשתקת גניםלא גורמת להשתקה, גם לא זמנית, בעיקר בתאים המתחלקים מהר. ניתן להתגבר על בעיה זו על ידי יצירתוקטור ביטויל-siRNA. בפלסמיד,רצף ה-siRNA משתנה, אך הוא צריך ליצור לולאה קצרה שבין שני הגדילים. תוצאת השעתוקשל הרצף היא מולקולתshRNA,אשר יכולה להיות מעובדת ל-siRNA פונקציונלי על ידי האנזיםDicer.קסטות שעתוק אופייניות משתמשות בפרומוטר שלRNA polymerase III(למשל U6 או H1) כדי לכוון את השעתוק שלRNA גרעיני קטן(snRNAs)(ה-U6 מעורב בשחבורגנים, H1 הוא רכיבRNaseשל RNase P של האדם).

הפעילות של siRNA ב-RNAi תלויה במידה רבה ביכולתו להיקשר לגורם ההשתקה המורכב של RISC) RNA). לאחר היקשרות דופלקס siRNA ל-RISC הוא נבקע לשני גדילים בודדים על ידי אנזים הנאנדונקלזס. רק אחד הגדילים נקשר ל-RISC, ואז כל הקומפלקס נקשר ל-mRNAהרצוי ומשתיק אותו (ההתבטאות של הגנים הוא מקודד).^[4]

שפעול RNA

dsRNA יכול גם להפעיל את ביטוי הגנים, מנגנון שזכה לכינוי "הפעלת גנים מושרה של RNA קטן" (RNAa). הוכח כי dsRNA שמטרתו היא פרומוטרים של גנים מעורר הפעלת שעתוק חזקה של הגנים הקשורים. RNAa הודגם בתאי אדם בעזרת dsRNA מלאכותי, המכונה "RNA משפעל קטן" (saRNA). בשלב זה לא ידוע אם RNAa מבוטא גם באורגניזמים אחרים.^[5]

השפעות לא רצויות

היות ש-RNAi מצטלב במסלולים רבים, אין זה מפתיע שבמקרה אנו מעוררים תופעות בלתי רצויות במהלך קידום המחקר של siRNA. כאשר תאים של יונקים פוגשים RNA דו גדילי, כגון siRNA, התא עלול לטעות ולטפל בו כנגיף, וכך לגרום לתגובה חיסונית.בנוסף, כיוון ש-microRNAמווסת התבטאות גנים על ידי אינטראקציות משלימות של זוג בסיסים עם ה-mRNAהרצוי, החדרת siRNA עלולה לגרום לדיכוי המטרה באופן בלתי צפוי.

חסינות מולדת

החדרת הרבה מולקולות של siRNA עלולה לגרום לאירועים בלתי צפויים עקב ההפעלה שלמערכת החיסוןהמולדת.^[6]רוב הראיות עד כה מצביעות על כך שזה כנראה תוצאה של הפעלת חיישן ה-PKRשל ה-dsRNA, על אף שגן חומצה רטינואית מושרה (RIG-I) יכול להיות מעורב גם. האינדוקציה שלציטוקיניםדרך קולטןTLR7גם תוארה כסיבה. אחת השיטות המבטיחות להפחתת תופעה זו היא להמיר את ה-siRNA לתוך microRNA. תהליך של microRNA מתרחש באופן טבעי בגוף, ועל ידי רתימת מסלולאנדוגניזה, אמור להיות אפשרי להשיג את אותו דיכוי גנים בריכוזים נמוכים יחסית של siRNA. זה אמור למזער את ההשפעות הלא רצויות.

יעד שגוי

אתגר נוסף לשימוש ב-siRNA לדיכוי גנים הוא פעולתו המוטעית על תאים שיש להם רצף לא משלים וחסימת התבטאות הגנים (למעשה, siRNA פועל כ-miRNA), דבר שמוביל לבעיות בעיבוד הנתונים ורעילות פוטנציאלית. עם זאת, ניתן לטפל בחלק מהבעיה על ידי תכנון ניסויי בקרה מתאימים, ועיצוב siRNA שהוא חופשי מטעיות אלה. נכון ל-2014, טכניקה כזו נמצאת בשלבי פיתוח.^[7]

יישומים ואתגרים טיפוליים

בהתחשבות ביכולת ה-siRNA להשתיק כל גן רצוי, פעולתו ב-RNAi יוצרת עניין רב בתחום הביולוגיה הבסיסית.^[8]ישנו שימוש הולך וגובר בו לזיהוי גנים חשובים במסלולים ביולוגיים שלוירואידים. עם זאת, יישום RNAi באמצעות siRNA בבעלי חיים, במיוחד בני אדם, מציב אתגרים רבים. לפי ניסויים, siRNA מראה יעילות שונה בסוגי תאים שונים באופן שעדיין לא מובן כל כך: תאים מסוימים מגיבים היטב ל-siRNA, בעוד שתאים אחרים לא מראים תגובה ברורה (אפילו שישטרנספקציהיעילה).

ראו גם

לקריאה נוספת

Hannon, G. J.; Rossi, J. J. (2004). "Unlocking the potential of the human genome with RNA interference". Nature 431 (7006): 371–378. Bibcode:2004Natur.431..371H. doi:10.1038/nature02870.PMID 15372045.

קישורים חיצוניים

מדיה וקבצים בנושאSiRNAבוויקישיתוף

RNAiAtlas,מאגר נתונים של ספריות siRNA, מטרותיהם וניתוח תוצאות

הערות שוליים

^Hamilton A, Baulcombe D (1999). "A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants". Science 286 (5441): 950–2. doi:10.1126/science.286.5441.950.PMID 10542148.
^Elbashir S, Harborth J, Lendeckel W, Yalcin A, Weber K, Tuschl T (2001). "Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells". Nature 411 (6836): 494–988. doi:10.1038/35078107.PMID 11373684
^Bernstein E, Caudy A, Hammond S, Hannon G (2001). "Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference". Nature 409 (6818): 363–6. doi:10.1038/35053110.PMID 11201747
^Daneholt, B. (2006). "Advanced Information: RNA interference". The Novel Prize in Physiology or Medicine
^Li LC (2008). "Small RNA-Mediated Gene Activation". RNA and the Regulation of Gene Expression: A Hidden Layer of Complexity. Caister Academic Press. isbn=978-1-904455-25-7.
^Whitehead, K. A.; Dahlman, J. E.; Langer, R. S.; Anderson, D. G. (2011). "Silencing or Stimulation? siRNA Delivery and the Immune System". Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering 2: 77–96. doi:10.1146/annurev-chembioeng-061010-114133.PMID 22432611
^Birmingham A, Anderson E, Reynolds A, Ilsley-Tyree D, Leake D, Fedorov Y, Baskerville S, Maksimova E, Robinson K, Karpilow J, Marshall W, Khvorova A (2006). "3' UTR seed matches, but not overall identity, are associated with RNAi off-targets". Nat Methods 3 (3): 199–204. doi:10.1038/nmeth854.PMID 16489337.
^Alekseev OM, Richardson RT, Alekseev O, O'Rand MG (2009). "Analysis of gene expression profiles in HeLa cells in response to overexpression or siRNA-mediated depletion of NASP". Reproductive Biology and Endocrinology 7: 45. doi:10.1186/1477-7827-7-45. PMC 2686705.PMID 19439102.

[^1-1] Hamilton A, Baulcombe D (1999). "A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants". Science 286 (5441): 950–2. doi:10.1126/science.286.5441.950.PMID 10542148.

[^2-2] Elbashir S, Harborth J, Lendeckel W, Yalcin A, Weber K, Tuschl T (2001). "Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells". Nature 411 (6836): 494–988. doi:10.1038/35078107.PMID 11373684

[^3-3] Bernstein E, Caudy A, Hammond S, Hannon G (2001). "Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference". Nature 409 (6818): 363–6. doi:10.1038/35053110.PMID 11201747

[^4-4] Daneholt, B. (2006). "Advanced Information: RNA interference". The Novel Prize in Physiology or Medicine

[^5-5] Li LC (2008). "Small RNA-Mediated Gene Activation". RNA and the Regulation of Gene Expression: A Hidden Layer of Complexity. Caister Academic Press. isbn=978-1-904455-25-7.

[^6-6] Whitehead, K. A.; Dahlman, J. E.; Langer, R. S.; Anderson, D. G. (2011). "Silencing or Stimulation? siRNA Delivery and the Immune System". Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering 2: 77–96. doi:10.1146/annurev-chembioeng-061010-114133.PMID 22432611

[^7-7] Birmingham A, Anderson E, Reynolds A, Ilsley-Tyree D, Leake D, Fedorov Y, Baskerville S, Maksimova E, Robinson K, Karpilow J, Marshall W, Khvorova A (2006). "3' UTR seed matches, but not overall identity, are associated with RNAi off-targets". Nat Methods 3 (3): 199–204. doi:10.1038/nmeth854.PMID 16489337.

[^8-8] Alekseev OM, Richardson RT, Alekseev O, O'Rand MG (2009). "Analysis of gene expression profiles in HeLa cells in response to overexpression or siRNA-mediated depletion of NASP". Reproductive Biology and Endocrinology 7: 45. doi:10.1186/1477-7827-7-45. PMC 2686705.PMID 19439102.

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]

חומצות גרעין
אבני בניין	נוקלאוזיד•נוקלאוטיד•דהאוקסינוקלאוטיד
פורין	אדנין (A)•גואנין (G)
פירימידינים	תימין (T)•ציטוזין (C)•אורציל (U)
RNA	רנ "א מקודד:mRNA•pre-mRNA רנ "א שאינו מקודדתרגום:tRNA•rRNA•tmRNA בקרה:miRNA•siRNA•piRNA•RNAi עריכת רנ "א:snRNA•snoRNA
DNA	cDNA