Pengurutan DNA

Pengurutan DNAadalah proses atau teknik penentuan urutanbasa nukleotidapada suatu molekulDNA.Urutan tersebut dikenal sebagaisekuens DNA,yang merupakan informasi paling mendasar suatugenataugenomkarena mengandung instruksi yang dibutuhkan untuk pembentukan tubuhmakhluk hidup.^[1]Sekuensing DNA dapat dimanfaatkan untuk menentukan identitas maupun fungsi gen atau fragmen DNA lainnya dengan cara membandingkan sekuens-nya dengan sekuens DNA lain yang sudah diketahui.^[2]Teknik ini digunakan dalam riset dasarbiologimaupun berbagai bidang terapan sepertikedokteran,^[3]bioteknologi,forensik,^[4]danantropologi.^[5]

Teknik sekuensing DNA mulai dikembangkan pada tahun 1970-an dan telah menjadi hal rutin dalam penelitianbiologi molekularpada dekade berikutnya berkat dua metode yang dikembangkan secara independen namun hampir bersamaan oleh timWalter GilbertdiAmerika Serikatdan timFrederick SangerdiInggrissehingga kedua ilmuwan tersebut mendapatkanPenghargaan Nobel Kimiapada tahun1980.^[6]^[7]Selanjutnya, metode Sanger menjadi lebih umum digunakan dan berhasil diautomatisasi pada pertengahan 1980-an. Sejak tahun 1995, berbagai proyekgenomyang bertujuan menentukan sekuens keseluruhan DNA pada banyakorganismetelah diselesaikan, termasukProyek Genom Manusia.Sekuensing DNA seluruh genom semakin terjangkau dan cepat dilakukan berkat pengembangan sejumlah teknik sekuensing generasi berikutnya mulai tahun 2000-an.

Aplikasi

Sekuens DNA menyandikan informasi yang diperlukan bagimakhluk hidupuntuk melangsungkan hidup danberkembang biak.Dengan demikian, penentuan sekuens DNA berguna di dalam ilmu pengetahuan 'murni' mengenai mengapa dan bagaimana makhluk hidup dapat hidup, selain berguna dalam penerapan praktis. Karena DNA merupakan ciri kunci makhluk hidup, pengetahuan akan sekuens DNA dapat berguna dalam penelitianbiologimanapun. Sebagai contoh, dalamilmu pengobatansekuensing DNA dapat digunakan untuk mengidentifikasi, mendiagnosis, dan mengembangkan pengobatanpenyakit genetik.Demikian pula halnya, penelitian pada agen penyebab penyakit (patogen) dapat membuka jalan bagi pengobatanpenyakit menular.Bioteknologi,yang dapat pula memanfaatkan sekuensing DNA, merupakan bidang yang berkembang pesat dan berpotensi menghasilkan banyak barang dan jasa berguna. Pengetahuan akan sekuens DNA berguna untuk mengetahui sekuensasam aminoyang disandikan oleh gen.^[8]

Karena RNA dibentuk dengantranskripsidari DNA, informasi yang dikandung RNA juga terdapat di dalam DNA cetakannya sehingga sekuensing DNA cetakan tersebut sudah cukup untuk membaca informasi pada RNA. Namun, sekuensingRNAdibutuhkan khususnya padaeukariota,karena molekul RNA eukariota tidak selalu sebanding dengan DNA cetakannya karena pemotonganintronsetelah prosestranskripsi.

Sejarah

Pada mulanya, sekuensing DNA dilakukan dengan mentranskripsikannyake dalam bentukRNAterlebih dahulu karena metode sekuensing RNA telah ditemukan sebelumnya. Pada 1965,Robert Holleydan timnya dariCornell UniversitydiNew York,Amerika Serikat,mempublikasikan sekuenstRNA alanindarikhamiryang terdiri atas 77nukleotida.^[9]Sekuensing tRNA tersebut membutuhkan waktu 7 tahun dan hasilnya merupakan sekuens molekulasam nukleatyang pertama kali dipublikasikan.^[10]Sekuens DNA yang pertama kali dipublikasikan adalah DNA sepanjang 12 nukleotida dari suatuvirus,yaitubakteriofaglambda, pada 1971, yang ditentukan dengan cara serupa oleh Ray Wu dan Ellen Taylor, keduanya juga dari Cornell University.^[11]^[12]

Pada 1975,Frederick Sangerdan Alan Coulson dari laboratorium biologi molekular Medical Research CouncilInggrisdiCambridgemempublikasikan metode sekuensing DNA secara langsung yang disebut teknik plus–minus.^[13]Dengan teknik tersebut, tim mereka berhasil melakukan sekuensing DNA sebagian besargenombakteriofag ΦX174 sepanjang 5.375 nukleotida yang dipublikasikan pada Februari 1977.^[14]Pada bulan yang sama, metode sekuensing DNA yang dicetuskan Allan Maxam danWalter GilbertdariHarvard UniversitydiCambridge, Massachusetts,Amerika Serikat,dipublikasikan.^[15]

Sejak pertengahan 1980-an, metode Sanger menjadi lebih umum digunakan.^[16]Pada 1986, timLeroy HooddiCalifornia Institute of TechnologydanApplied Biosystemsberhasil membuat mesin sekuensing DNA automatis berdasarkan metode Sanger.^[17]^[18]

Metode

Metode Maxam-Gilbert

Metode ini mulanya cukup populer karena dapat langsung menggunakan DNA hasil pemurnian, sedangkan metode Sanger pada waktu itu memerlukankloninguntuk membentuk DNA untai tunggal. Seiring dengan dikembangkannya metode terminasi rantai, metode sekuensing Maxam-Gilbert menjadi tidak populer karena kerumitan teknisnya, digunakannya bahan kimia berbahaya, dan kesulitan dalamscale-up.

Metode Sanger

Gel sekuensing metode Sanger yang telah dilabel radioaktif.

Dewasa ini, hampir semua usaha sekuensing DNA dilakukan dengan menggunakanmetode terminasi rantaiyang dikembangkan olehFrederick Sangerdan rekan-rekannya[1]^{[pranala nonaktif permanen]}.Teknik tersebut melibatkan terminasi atau penghentian reaksi sintesis DNAin vitroyang spesifik untuk sekuens tertentu menggunakan substrat nukleotida yang telah dimodifikasi.

Pada metode terminasi rantai (metode Sanger), perpanjangan atau ekstensi rantai DNA dimulai pada situs spesifik pada DNA cetakan dengan menggunakan oligonukleotida pendek yang disebutprimeryang komplementer terhadap DNA pada daerah situs tersebut.Primertersebut diperpanjang menggunakanDNA polimerase,enzim yang mereplikasiDNA. Bersama denganprimerdan DNA polimerase, diikutsertakan pula empat jenis basadeoksinukleotida(satuan pembentuk DNA), juga nukleotida pemutus atau penghenti rantai (terminatorrantai) dalam konsentrasi rendah (biasanyadi-deoksinukleotida). Penggabungan nukleotida pemutus rantai tersebut secara terbatas kepada rantai DNA oleh polimerase DNA menghasilkan fragmen-fragmen DNA yang berhenti bertumbuh hanya pada posisi pada DNA tempat nukleotida tertentu tersebut tergabungkan. Fragmen-fragmen DNA tersebut lalu dipisahkan menurut ukurannya denganelektroforesis gel poliakrilamida,atau sekarang semakin lazim dengan elektroforesis menggunakan tabung gelas berjari-jari kecil (pipa kapiler) yang diisi dengan polimer kental.

Seiring dengan perkembangannya, kini terdapat beberapa macam metode sekuensing terminasi rantai yang berbeda satu sama lain terutama dalam hal pendeteksian fragmen DNA hasil reaksi sekuensing.

Metode Sanger asli

Pada metode yang asli, urutan nukleotida DNA tertentu dapat disimpulkan dengan membuat secara paralel empat reaksi perpanjangan rantai menggunakan salah satu dari empat jenis basa pemutus rantai pada masing-masing reaksi. Fragmen-fragmen DNA yang kemudian terbentuk dideteksi dengan menandai (labelling)primeryang digunakan denganfosfor radioaktifsebelum reaksi sekuensing dilangsungkan. Keempat hasil reaksi tersebut kemudian dielektroforesispada empat lajur yang saling bersebelahan pada gel poliakrilamida.
Hasil pengembangan metode ini menggunakan empat macamprimeryang ditandai dengan pewarnaberpendar(fluorescent dye). Hal ini memiliki kelebihan karena tidak menggunakan bahanradioaktif;selain menambah keamanan dan kecepatan, keempat hasil reaksi dapat dicampur dan dielektroforesis pada satu lajur pada gel. Metode ini dikenal sebagai metodedye primer sequencing.

Sekuensingdye terminator

Contoh hasil bacaan suatu sekuensing metodedye terminator.

Cara lain pelabelan primer adalah dengan melabel pemutus rantainya, lazim disebut metode sekuensingdye terminator.Keunggulan cara ini adalah bahwa seluruh proses sekuensing dapat dilakukan dalam satu reaksi, dibandingkan dengan empat reaksi terpisah yang diperlukan pada penggunaanprimerberlabel. Pada cara tersebut, masing-masing dideoksinukleotida pemutus rantai ditandai dengan pewarna fluoresens, yang berpendar padapanjang gelombangyang berbeda-beda. Cara ini lebih mudah dan lebih cepat dibandingkan penggunaanprimerberwarna, namun dapat menimbulkan ketidaksamaan tinggi kurva atau puncak (peak) yang disebabkan oleh ketidaksamaan penggabungan pemutus rantai berwarna berukuran besar pada pertumbuhan DNA (ketidaksamaan tersebut bergantung pada DNA cetakan). Masalah tersebut telah dapat dikurangi secara nyata dengan penggunaan macam-macam enzim dan pewarna baru yang meminimalkan perbedaan dalam penggabungan.
Metode ini kini digunakan pada sebagian besar usaha reaksi sekuensing karena lebih sederhana dan lebih murah.Primer-primeryang digunakan tidak perlu dilabel secara terpisah (yang bisa jadi cukup mahal untukprimeryang dibuat untuk sekali pakai), walaupun hal tersebut tidak terlalu bermasalah dalam penggunaanuniversal primer.

Automatisasi dan penyiapan sampel

Mesin sekuensing DNA automatis modern mampu mengurutkan 384 sampel berlabel fluoresens sekaligus dalam sekalibatch(elektroforesis) yang dapat dilakukan sampai 24 kali sehari. Hal tersebut hanya mencakup proses pemisahan dan proses pembacaan kurva; reaksi sekuensing, pembersihan, dan pelarutan ulang dalamlarutan penyanggayang sesuai harus dilakukan secara terpisah.

Untuk memperoleh hasil reaksi berlabel yang dapat dideteksi dari DNA cetakan, metode "sekuensing daur" (cycle sequencing) paling lazim dilakukan. Dalam metode ini dilakukan berturut-turut penempelanprimer(primer annealing), ekstensi oleh polimerase DNA, dan denaturasi (peleburan ataumelting) untai-untai DNA cetakan secara berulang-ulang (25–40 putaran). Kelebihan utama sekuensing daur adalah lebih efisiennya penggunaan pereaksi sekuensing yang mahal (BigDye) dan mampunya mengurutkan templat dengan struktur sekunder tertentu sepertihairpin loopatau daerah kaya-GC. Setiap tahap pada sekuensing daur ditempuh dengan mengubah temperatur reaksi menggunakan mesin pendaur panas (thermal cycler)PCR.Cara tersebut didasarkan pada fakta bahwa dua untai DNA yang komplementer akan saling menempel (berhibridisasi) pada temperatur rendah dan berpisah (terdenaturasi) pada temperatur tinggi. Hal penting lain yang memungkinkan cara tersebut adalah penggunaan enzim DNA polimerase dari organisme termofilik (organisme yang hidup di lingkungan bertemperatur tinggi), yang tidak mudah terurai pada temperatur tinggi yang digunakan pada cara tersebut (>95 °C).

Sekuensing generasi berikutnya

Pyrosequencing

Pyrosequencing adalah teknik pemetaanDNAyang berdasarkan deteksi terhadappirofosfat(PPi) yang dilepaskan selamasintesisDNA.^[19]Teknik ini memanfaatkanreaksi enzimatikyang dikatalisis olehATP sulfurilasedanluciferaseuntuk pirofosfat inorganik yang dilepaskan selama penambahannukleotida.^[19]

Illumina(Solexa)

Metode sekuensing ini ditemukan oleh perusahaan Illumina. Sekuensing Illumina menggunakan primer yang akan berkomplemen dengan adaptor yang telah disediakan oleh perusahaan pada sebuah plat. Proses sekuensing ini menggunakan teknikbridge PCR,yaitu terbentuknya jembatan pada saat elongasi. Nukleotida penghenti akan diberikan dan pendaranan fluoresens akan direkam oleh kamera.^[20]

Sekuensing DNA skala besar

Metode sekuensing DNA yang kini ada hanya dapat merunut sepotong pendek DNA sekaligus. Contohnya, mesin sekuensing modern yang menggunakan metode Sanger hanya dapat mencakup paling banyak sekitar 1000 pasang basa setiap sekuensing[2].Keterbatasan ini disebabkan olehprobabilitasterminasi rantai yang menurun secara geometris seiring dengan bertambahnya panjang rantai, selain keterbatasan fisik ukuran dan resolusi gel.

Sekuens DNA dengan ukuran jauh lebih besar kerap kali dibutuhkan. Sebagai contoh,genom bakterisederhana dapat mengandung jutaan pasang basa, sedangkangenom manusiaterdiri atas lebih dari 3 miliar pasang basa. Berbagai strategi telah dikembangkan untuk sekuensing DNA skala besar, termasuk strategiprimer walkingdanshotgun sequencing.Kedua strategi tersebut melibatkanpembacaanbanyak bagian DNA dengan metode Sanger dan selanjutnya menyusun hasil pembacaan tersebut menjadi sekuens yang runut. Masing-masing strategi memiliki kelemahan sendiri dalam hal kecepatan dan ketepatan; sebagai contoh, metodeshotgun sequencingmerupakan metode yang paling praktis untuk sekuensing genom ukuran besar, namun proses penyusunannya rumit dan rentan kesalahan.

Data sekuens bermutu tinggi lebih mudah didapatkan bila DNA bersangkutan dimurnikan dari pencemar yang mungkin terdapat pada sampel dan diamplifikasi. Hal ini dapat dilakukan dengan metodereaksi berantai polimerasebilaprimeryang dibutuhkan untuk mencakup seluruh daerah yang diinginkan cukup praktis dibuat. Cara lainnya adalah dengan kloning DNA sampel menggunakan vektor bakteri, yaitu memanfaatkan bakteri untuk "menumbuhkan" salinan DNA yang diinginkan sebanyak beberapa ribu pasang basa sekaligus. Biasanya proyek-proyek sekuensing DNA skala besar memiliki persediaanpustakahasil kloning semacam itu.

Lihat pula

Referensi

^(Inggris)Rogers, K., ed. (2011),New Thinking about Genetics,New York: Britannica Educational Publishing, hlm. 132(lihatdi Penelusuran Buku Google)
^(Inggris)Glick, B.R., Pasternak, J.J., Patten, C.L. (2010).Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA(edisi ke-4). Washington, DC: ASM Press. hlm. 117–118.(lihatdi Penelusuran Buku Google)
^(Inggris)Sweet, K.M., Michaelis, R.C. (2011).The Busy Physician's Guide to Genetics, Genomics and Personalized Medicine.Dordrecht: Springer. hlm. 76.(lihatdi Penelusuran Buku Google)
^(Inggris)Bieber, F.R. (2004), "Science and Technology of Forensic DNA Profiling: Current Use and Future Directions", dalam Lazer, D. (Penyunting),DNA and the Criminal Justice System: the Technology of Justice,Cambridge, MA: MIT Press, hlm. 30(lihatdi Penelusuran Buku Google)
^(Inggris)Scheffler, I.E. (2008), "Mitochondrial DNA Sequencing and Anthropology",Mitochondria(edisi ke-2), Hoboken, NJ: John Wiley & Sons(lihatdi Penelusuran Buku Google)
^(Inggris)Sambrook, J., Russel, D.W. (2001).Molecular Cloning: A Laboratory Manual.Volume ke-2 (edisi ke-3). Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press. hlm. 12.3.(lihatdi Penelusuran Buku Google)
^Glicket al.(2010)hlm. 110
^(Inggris)Allison, L.A. (2007).Fundamental Molecular Biology.Malden, MA: Blackwell Publishing. hlm.223.(lihatdi Penelusuran Buku Google)
^Holley, R.W.; Apgar, J.; Everett, G.A.; Madison, J.T.; Marquisee, M.; Merrill, S.H.; Penswick, J.R.; Zamir, A. (19 Maret 1965). "Structure Of A Ribonucleic Acid".Science.147(3664): 1462–1465.doi:10.1126/science.147.3664.1462.
^(Inggris)Goujon, P. (2001).From Biotechnology to Genomes: The Meaning of the Double Helix.Singapore: World Scientific Publishing. hlm.140.(lihatdi Penelusuran Buku Google)
^Wu, R.; Taylor, E. (14 Mei 1971). "Nucleotide sequence analysis of DNA: II. Complete nucleotide sequence of the cohesive ends of bacteriophage λ DNA".Journal of Molecular Biology.57(3): 491–511.doi:10.1016/0022-2836(71)90105-7.
^(Inggris)Reece, R.J. (2004).Analysis of Genes and Genomes.Chichester: John Wiley & Sons. hlm.295–296.(lihatdi Penelusuran Buku Google)
^Sanger, F.; Coulson, A.R. (1975), "A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase",Journal of Molecular Biology,94(3): 441–448,doi:10.1016/0022-2836(75)90213-2
^Sanger, F.; Air, G.M.; Barrell, B.G.; Brown, N.L.; Coulson, A.R.; Fiddes, C.A.; Hutchinson, C.A.; Slocombe, P.M.; Smith, M. (1977), "Nucleotide sequence of bacteriophage φX174 DNA",Nature,265(5596): 687–695,doi:10.1038/265687a0
^Maxam, A.M.; Gilbert, W. (1977), "A new method for sequencing DNA",Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,74(2), hlm. 560–564,doi:10.1073/pnas.74.2.560
^(Inggris)Fitzgerald-Hayes, M., Reichsman, F. (2010).DNA and Biotechnology.Burlington, MA: Academic Press. hlm. 137.(lihatdi Penelusuran Buku Google)
^Allison (2007)hlm. 226
^(Inggris)Davies, K. (2002).Cracking the Genome: Inside the Race to Unlock Human DNA.Baltimore, MD: The Johns Hopkins University Press. hlm.144.(lihatdi Penelusuran Buku Google)
^^a ^b(Inggris)Poirel L, Naas T, Nordmann P. 2006. Pyrosequencing as a Rapid Tool for Identification of GES-Type Extended-Spectrum Lactamases.J Clin Microbiol44(8):3008-11.
^(Inggris)Nejad AM, Narimani Z, Hosseinkhan N. 2013.Next Generation Sequencing and Sequence Assembly.New York: Springer

Pranala luar

(Inggris)Informasi mengenai proyek genom berbagai organisme dan data yang dihasilkandi National Center for Biotechnology Information, A.S.
(Inggris)(2005)Genome Sequencing: Using Models to Predict Who's Next.^{[pranala nonaktif permanen]}PLoS Biol 3(1): e25.

[1] (Inggris)Rogers, K., ed. (2011),New Thinking about Genetics,New York: Britannica Educational Publishing, hlm. 132(lihatdi Penelusuran Buku Google)

[2] (Inggris)Glick, B.R., Pasternak, J.J., Patten, C.L. (2010).Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA(edisi ke-4). Washington, DC: ASM Press. hlm. 117–118.(lihatdi Penelusuran Buku Google)

[3] (Inggris)Sweet, K.M., Michaelis, R.C. (2011).The Busy Physician's Guide to Genetics, Genomics and Personalized Medicine.Dordrecht: Springer. hlm. 76.(lihatdi Penelusuran Buku Google)

[4] (Inggris)Bieber, F.R. (2004), "Science and Technology of Forensic DNA Profiling: Current Use and Future Directions", dalam Lazer, D. (Penyunting),DNA and the Criminal Justice System: the Technology of Justice,Cambridge, MA: MIT Press, hlm. 30(lihatdi Penelusuran Buku Google)

[5] (Inggris)Scheffler, I.E. (2008), "Mitochondrial DNA Sequencing and Anthropology",Mitochondria(edisi ke-2), Hoboken, NJ: John Wiley & Sons(lihatdi Penelusuran Buku Google)

[6] (Inggris)Sambrook, J., Russel, D.W. (2001).Molecular Cloning: A Laboratory Manual.Volume ke-2 (edisi ke-3). Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press. hlm. 12.3.(lihatdi Penelusuran Buku Google)

[7] Glicket al.(2010)hlm. 110

[8] (Inggris)Allison, L.A. (2007).Fundamental Molecular Biology.Malden, MA: Blackwell Publishing. hlm.223.(lihatdi Penelusuran Buku Google)

[9] Holley, R.W.; Apgar, J.; Everett, G.A.; Madison, J.T.; Marquisee, M.; Merrill, S.H.; Penswick, J.R.; Zamir, A. (19 Maret 1965). "Structure Of A Ribonucleic Acid".Science.147(3664): 1462–1465.doi:10.1126/science.147.3664.1462.

[10] (Inggris)Goujon, P. (2001).From Biotechnology to Genomes: The Meaning of the Double Helix.Singapore: World Scientific Publishing. hlm.140.(lihatdi Penelusuran Buku Google)

[11] Wu, R.; Taylor, E. (14 Mei 1971). "Nucleotide sequence analysis of DNA: II. Complete nucleotide sequence of the cohesive ends of bacteriophage λ DNA".Journal of Molecular Biology.57(3): 491–511.doi:10.1016/0022-2836(71)90105-7.

[12] (Inggris)Reece, R.J. (2004).Analysis of Genes and Genomes.Chichester: John Wiley & Sons. hlm.295–296.(lihatdi Penelusuran Buku Google)

[13] Sanger, F.; Coulson, A.R. (1975), "A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase",Journal of Molecular Biology,94(3): 441–448,doi:10.1016/0022-2836(75)90213-2

[14] Sanger, F.; Air, G.M.; Barrell, B.G.; Brown, N.L.; Coulson, A.R.; Fiddes, C.A.; Hutchinson, C.A.; Slocombe, P.M.; Smith, M. (1977), "Nucleotide sequence of bacteriophage φX174 DNA",Nature,265(5596): 687–695,doi:10.1038/265687a0

[15] Maxam, A.M.; Gilbert, W. (1977), "A new method for sequencing DNA",Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,74(2), hlm. 560–564,doi:10.1073/pnas.74.2.560

[16] (Inggris)Fitzgerald-Hayes, M., Reichsman, F. (2010).DNA and Biotechnology.Burlington, MA: Academic Press. hlm. 137.(lihatdi Penelusuran Buku Google)

[17] Allison (2007)hlm. 226

[18] (Inggris)Davies, K. (2002).Cracking the Genome: Inside the Race to Unlock Human DNA.Baltimore, MD: The Johns Hopkins University Press. hlm.144.(lihatdi Penelusuran Buku Google)

[poirel-19] (Inggris)Poirel L, Naas T, Nordmann P. 2006. Pyrosequencing as a Rapid Tool for Identification of GES-Type Extended-Spectrum Lactamases.J Clin Microbiol44(8):3008-11.

[satu-20] (Inggris)Nejad AM, Narimani Z, Hosseinkhan N. 2013.Next Generation Sequencing and Sequence Assembly.New York: Springer

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]

[9]

[10]

[11]

[12]

[13]

[14]

[15]

[16]

[17]

[18]

[19]

[20]