Elettroforesi su gel di agarosio

L'elettroforesisugeldiagarosioè una tecnica classicamente utilizzata per analizzare e separareacidi nucleici.Questa tecnica sfrutta le cariche presenti nelle molecole diDNAoRNA(caricate negativamente) per farle migrare, in un campo elettrico, attraverso un gel diagarosio.Il gel funge da setaccio, essendo costituito da una rete di pori, i quali consentono di separare le molecole in base alla loro grandezza: quelle più piccole attraversano più velocemente i pori rispetto a quelle più grandi quindi si avrà una separazione in funzione della velocità.

Gel di agarosio (vista dall'alto). Sono ben visibili i "pozzetti"

Vaschetta per elettroforesi su gel

Caricamento dei "pozzetti" del gel con il campione da analizzare

Particolare del caricamento dei "pozzetti"

Taglio del gel, sotto luce UV, per l'eventuale recupero delle sostanze separate

Struttura dell'agarosio

L'agarosio è unpolisaccaridelineare e neutro formato da unità di D-galattosioe di 3,6-anidro-L-galattosio legate alternativamente con legami glicosidici. L'agarosio è uno zucchero solubile in acqua allatemperatura di ebollizione,mentre diventa solido man mano che si raffredda formando una matrice attraverso dei legami a idrogeno tra le catene lineari. L'agarosio non è l'unico composto utilizzato per i gel, infatti, esistono diversi tipi di supporti utilizzabili: come ad esempio l'amidoo miscele di agarosio epoliacrilammide(che consentono una più fine separazione delle molecole).

Caricamento dei campioni

I campioni da analizzare vanno depositati, con unamicropipetta,in apposite fenditure verticali, dette "pozzetti", praticate nel gel a poca distanza dal margine dalla parte del polo negativo. Essendo il DNA un polianione i frammenti migreranno in avanti verso il polo positivo. All'atto del caricamento, al campione viene solitamente aggiunta una "soluzione di caricamento", colorata generalmente conblu di bromofenoloexilene cianolo,contenentegliceroloper agevolare la precipitazione del campione sul fondo del pozzetto.

Taratura del gel

L'elettroforesi su gel è una tecnica ideale per determinare le dimensioni dei frammenti di DNA digeriti conenzimi di restrizione.Per questo scopo è necessario costruire una curva ditaraturain grado di fornire un valore approssimativo sulle reali dimensioni delle molecole di DNA. Per la taratura bisogna far migrare nel gel un marcatore contenente frammenti di DNA di dimensioni già note. Da questo si vede che esiste una relazione di linearità fra illogaritmodelle dimensioni del frammento e la distanza percorsa dal gel. Dalla curva di taratura è perciò possibile stabilire le dimensioni dei frammenti di DNA.

Colorazione degli acidi nucleici

Per consentire la visualizzazione degli acidi nucleici migrati si possono utilizzare diversi tipi di coloranti; quello più usato in assoluto è l'etidio bromuro.Questa molecola planare si inserisce (intercala) tra le basi dell'acido nucleico a doppio filamento, ed emette lucefluorescentequando irradiata conluce ultravioletta(300 nm). L'etidio bromuro può essere aggiunto direttamente al gel (la velocità di migrazione si riduce del 10-15 %), al campione, o, alternativamente, dopo l'elettroforesi. Altri tipi di colorazioni utilizzano: sali diargento,blu cresile brillante,blu di metilene,GelRed,GelGreen.

Gel all'1% di agarosio prima di essere esposto a luce UV

Gel esposto a luce ultravioletta, ilbromuro di etidiolegato al DNA emana luce fluorescente arancione

Frammenti Di DNA separati tramite elettroforesi su gel, colorati conetidio bromuroed esposti a luce ultravioletta

Bibliografia

• Philip Serwer,Agarose gels: Properties and use for electrophoresis,inElectrophoresis,vol. 4, n. 6, 1983, pp. 375–382,DOI:10.1002/elps.1150040602.URL consultato l'11 marzo 2016.

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