ELISA

ELISAis eenacroniemvoor een laboratoriumtest voor het meten vanmacromoleculairestoffen zoals eiwitten inbloedmonsters.De naam is een afkorting vanenzyme-linked immunosorbent assay.Een andere term voor ELISA isenzyme immunoassay(enzymimmunoassay).

ELISA is een immunochemische reactie en alle immunochemische bepalingen zijn gebaseerd op hetzelfde principe, de specifieke binding tussenantigeenenantistof.Door het aantonen daarvan in het bloed, serum of andere lichaamsvloeistof van een mens of een dier is het mogelijk bij te dragen aan de diagnose van eeninfectieziekteof eenauto-immuunziekte.

Microtiterplaat

Detectie

Het opsporen gebeurt door binding van de eiwitten met antilichamen diegelabeldzijn. Dit wil zeggen dat zechemischgekoppeld worden aan eenenzymzoalsperoxidasedat via een of meer tussenstappen een kleurstof doet ontstaan. Hoe meer van de te detecteren stof aanwezig was, hoe meer enzymwerking gebonden wordt en hoe meer kleurstof er uiteindelijk ontstaat.

Protocol

1. Het monster wordt opgebracht op een onderlaag (plastic plaatje dat eiwittenadsorbeert)
2. Er wordt geblokkeerd met eiwit (BSA) omniet-specifiekebinding van de antilichamen tegen te gaan.

   

   Het aanbrengen van serum op eenmicrotiterplaatvoor een ELISA

3. Spoel de plaat metbufferoplossingvrij van ongebonden monster
4. Voeg het antilichaam toe
5. Spoel de ongebonden antilichamen weg
6. Als er twee antilichamen gebruikt worden:
   1. Spoel metBSA(ofkoemelk) zodataspecifiekebindingen van het tweede antilichaam veel minder waarschijnlijk worden
   2. Voeg het tweede antilichaam toe.
   3. Spoel de plaat, zodat niet-gebonden antistoffen verdwijnen
7. Voeg een chemische stof (TMB) toe die met het gebonden enzym reageert tot een meetbaar reactieproduct, bijvoorbeeld een kleurstof.
8. Meet de concentratie van het reactieproduct; deze is dan een maat voor de hoeveelheid aanwezige eiwitten.

Varianten

Er kan ook gebruikgemaakt worden van twee verschillendeantilichamen(secundaire detectie):

1. Sandwich ELISA: Een ongemerkt antilichaam wordt voor de stof die gemeten wil worden gepipetteerd in de welletjes.
2. Indirecte ELISA: Een gelabeld antilichaam tegen het constante gedeelte het eerste antilichaam. ( "Constant" slaat hier op een gedeelte van de "zware keten" die elk antilichaam van dat type (bijvoorbeeld IgG) gemeen heeft).

Het eerste antilichaam kan bijvoorbeeld afkomstig zijn van eenkonijnwaarbij een immuunreactie is opgewekt tegen de gezochte stof (door boostervaccinatie met die stof). Het tweede antilichaam is afkomstig van een ander dier (bijvoorbeeld eenezel). Het gebruik van meerdere antilichamen levert aanzienlijke voordelen op:

• Signaalversterking: per eerste antilichaam kunnen meerdere tweede antilichamen binden.
• Schaalvergroting: het tweede antilichaam hoeft alleen maar specifiek tegen de donor van het eerste te zijn, niet zozeer tegen een bepaalde stof, waardoor productie veel grootschaliger en goedkoper kan.

IJking

ZieIJkingvoor het hoofdartikel over dit onderwerp.

Om de hoeveelheid te bepalen worden van tevoren verdunningen met bekende concentraties van de te meten stof gemaakt en tevens verdunningen van het monster. Omdat de hoeveelheid signaal evenredig is met de hoeveelheid enzym, kan bepaald worden wat de concentratie in het monster is. Een voorbeeld is de dopingtest: door concentraties te meten en te vergelijken met de toegestane (van nature aanwezige) concentraties, wordt een atleet gecontroleerd op doping.

Bepaling

Als de plaat gekleurd is, is de plaat klaar om gelezen te worden. Dit gebeurt met een ELISA reader op basis van een spectrofotometrische bepaling. Bij deze bepaling wordt gebruikgemaakt van twee golflengten zodat de bepaling nauwkeuriger is. Bij een hogere golflengte hebben sterke kleuringen namelijk geen invloed. Er bestaat ook eenPCR-ELISA-test.

Zie ook

• Multititerplaat

··

Immunologie