Sequenciamento

Embiologia molecular,sequenciamento^{(português brasileiro)}ousequenciação^{(português europeu)}é o processo de determinação da ordem sequencial das partes constituintes de umbiopolímeronão ramificado, isto é, a ordem denucleotídeosde umamoléculadeDNAouRNA,ou deaminoácidosde umaproteína.Osequenciamentoresulta numa representação linear simbólica conhecida comosequência,a qual sucintamente resume aestrutura da molécula sequenciada.^[1]

Sequenciamento de DNA

Sequenciamento de DNA é o processo de determinação da ordem dos nucleotídeos de um dado fragmento de DNA. Até o momento, a maioria dos sequenciamentos de DNA foram feitas usando o método de terminadores de cadeia (método de Sanger) desenvolvido porFrederick Sanger.Esta técnica tem como princípio a terminação sequência-específica da reação de síntese de DNA utilizando nucleotídeos modificados, análogos aosdNTPsnormais.^[2]Porém, novas tecnologias de sequenciamento, como opirosequenciamento,estão ganhando força. Entre as principais vantagens desta nova tecnologia estão a rapidez e o custo reduzido do processo.^[3]

A sequência dosácidos nucleicos codificaas informações necessárias à sobrevivência e à reprodução dosseres vivos.A determinação destas sequências é útil à pesquisa básica, para compreender como funciona a vida, assim como oferece soluções em âmbito aplicado. Em função do papel chave do DNA para os seres vivos, o conhecimento sobre a sequência de DNA pode ser útil em praticamente qualquer área da pesquisa em biologia. Por exemplo, namedicinaela pode ser útil para identificar,diagnosticare potencialmente desenvolver tratamentos paradoenças genéticas.Em pesquisas envolvendo patógenos, o sequenciamento pode levar a tratamentos paradoenças contagiosas.De maneira similar, abiotecnologiapode utilizar as facilidades do sequenciamento para desenvolver produtos e serviços.^[4]^[5]

Parte de um gel de sequenciamento, pelo método de Sanger, marcadoradioativamente

Sequenciamento pelo método de Sanger

O sequenciamento pelo método de terminadores de cadeia (método de Sanger) envolve a síntese de DNA a partir deprimers,pequenos moldes de DNA (oligonucleotídeos) complementares a uma região específica de DNA. A partir desta região, uma nova fita de DNA é produzida, pela ação de umaenzimacapaz de replicar DNA: aDNA polimerase.Na reação, juntamente com os primers e a enzima, são adicionados os 4desoxinucleotídeos(dNTPs deA,T,CeG); e uma pequena concentração de nucleotídeos terminadores (mais comumente umdideoxinucleotídeo:ddNTP de A, T, C e G). A incorporação limitada dos terminadores na cadeia crescente de DNA, pela DNA polimerase, interrompe a extensão da fita no ponto de inserção do nucleotídeo terminador específico, o qual foi utilizado na reação. São procedidas reações envolvendo os 4 ddNTPs separadamente, de modo a gerar fragmentos terminados nos 4 ddNTPs existentes. Isto produz fragmentos truncados da sequência completa de interesse. Os fragmentos obtidos, possuindo diferentes tamanhos, são separados porpeso molecularem processos deeletroforeseemgelde agarose (ver imagem ao lado), ou mais comumente através decapilarespreenchidos por umpolímeroviscoso, no qual os fragmentos correm, ordenadamente, dos mais leves aos mais pesados.^[6]

Os primers que participam de cada uma dasreações,envolvendo separadamente cada um dos terminadores, podem possuir marcadores que os identificam, porém, em alternativa a marcação dos primers, os terminadores podem ser marcados. A vantagem desta estratégia reside na possibilidade de se fazer o sequenciamento completo em apenas uma reação, ou seja, sem a necessidade de proceder uma reação específica com cada um dos ddNTPs isoladamente. Cada um dos quatro ddNTPs são marcados com umfluorocromodiferente, o qual emitefluorescênciaa um determinadocomprimento de onda.A marcação dos ddNTPs ao invés dos primers resulta em um método mais rápido e fácil.^[7]

Pirosequenciamento

Pirosequenciamento é uma técnica de sequenciamento desenvolvida por Pål Nyhren e Mostafa Ronaghi. Esta técnica tem como princípio a detecção dopirofosfatoliberado durante a incorporação do nucleotídeo, ao invés da terminação da cadeia de DNA com ddNTPs. De maneira geral, no pirosequenciamento, fitas simples de DNA são aneladas abeads(grânulos) e amplificados viaEmPCR(emulsion-based PCR). Estas moléculas de DNA associadas a beads são então colocadas em placas, localizadas próximas a umafibra ótica,juntamente com enzimas que produzemluzna presença deATP.Quando nucleotídeos (dNTPs) são adicionados à reação, luzes passam a ser emitidas a medida que estes são incorporados sequencialmente a cadeia crescente de DNA. Os diferentes sinais luminosos são registrados por um detector defótonsdo aparelho. As últimas plataformas de sequenciamento desenvolvidas são capazes de sequenciar, aproximadamente, 25 x 10⁶basesem 4,5 horas, por meio de uma única plataforma de sequenciamento.^[8]

Sequenciamento de RNA

Moléculas de RNA são menos estáveis nascélulas,e também mais propensas a degradação por nucleases em procedimentos experimentais. Como omRNAé gerado portranscriçãoa partir do DNA, a informação genética que estes carregam está presente no DNA celular. Porém, muitas vezes, a sequência de RNA é requerida, principalmente nos casos de mRNAseucarióticos,os quais não necessariamente correspondem a sequência exata da fita molde de DNA, uma vez que osíntronssão removidos durante o processamento do mRNA. Para sequenciar RNA, é usual se proceder umatranscrição reversaa partir da sequência contida na fita simples de RNA, gerando uma cópia decDNApor meio deRT-PCR,a qual poderá ser sequenciada como descrito acima.^[9]

Sequenciamento de proteínas

Métodos para realizar o sequenciamento de proteínas incluir:^[10]

Degradação de Edman
Peptide mass fingerprinting(PMF)
Espectrometria de massa
Protease digests

Se o gene que codifica a proteína é conhecido, atualmente é muito mais fácil sequenciar oDNAe inferir a sequência da proteína. Determinar parte da sequência deaminoácidosde umaproteína(geralmente uma extremidade) por um dos métodos acima pode ser suficiente para identificar um clone portador desse gene.

Sequenciamento de polissacarídeos

Embora os polissacarídeos também sejambiopolímeros,não é tão comum falar em "sequenciar" um polissacarídeo, por várias razões. Embora muitos polissacarídeos sejam lineares, muitos têm ramos. Muitas unidades diferentes (monossacarídeosindividuais) podem ser usadas e ligadas de maneiras diferentes. No entanto, a principal razão teórica é que, enquanto os outros polímeros listados aqui são gerados primariamente de maneira "dependente de modelo" por uma enzima processiva, cada união individual em um polissacarídeo pode ser formada por uma enzima diferente. Em muitos casos, oassemblynão é especificado exclusivamente; Dependendo de qual enzima atua, uma das várias unidades diferentes podem ser incorporada. Isso pode levar à formação de uma família de moléculas semelhantes. Isto é particularmente verdadeiro para polissacarídeos vegetais. Métodos para a determinação da estrutura deoligossacarídeosepolissacarídeosincluem espectroscopia de RMN e análise de metilação.^[11]

Referências

↑SMITH, A.. Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology. New York: Oxford University Press, 2000. 672 p.ISBN 978-0198506737
↑GARRET, R. H.; GRISHAM, C. M.. Biochemistry. 4. ed. Massachusetts: Brooks Cole, 2008. 1184 p.ISBN 978-0495109358
↑PEVSNER, J.. Bioinformatics and Functional Genomics. 2. ed. New Jersey: Wiley-Blackwell, 2009. 992 p.ISBN 978-0470085851
↑GRAHAM, C. A.; HILL, A. J. M.. DNA Sequencing Protocols. 2. ed. New Jersey: Humana Press, 2001. 244 p.ISBN 978-0896037212
↑KONEMAN, E. W.. Koneman's Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology. 6. ed. Maryland: Lippincott Williams & Wilkins, 2005. 1736 p.ISBN 978-0781730143
↑PRIMROSE, S. D.; TWYMAN, R.. Principles of Gene Manipulation and Genomics. 7. ed. Massachusetts: Wiley-Blackwell, 2006. 672 p.ISBN 978-1405135443
↑WALKER, J. M.; RAPLEY, R.. Molecular Biology and Biotechnology. 5. ed. Cambridge: Royal Society of Chemistry, 2009. 604 p.ISBN 978-0854041251
↑GLICK, B. R.; PASTERNAK, J. J.; PATTEN, C. L.. Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA. 4. ed. Washington: ASM Press, 2009. 1000 p.ISBN 978-1555814984
↑BLACKBURN, G. M.; GAIT, M. J.; LOAKES, D. WILLIAMS, D.. Nucleic Acids in Chemistry and Biology. Cambridge: Royal Society of Chemistry, 2006. 586 p.ISBN 978-0854046546
↑BURLINGAME, A. L.; CARR, S. A.. Mass Spectrometry in the Biological Sciences. New Jersey: Humana Press, 1996. 570 p.ISBN 978-0896033405
↑«Introduction».www.stenutz.eu.Consultado em 14 de abril de 2024

Ligações externas

nature.com - sequencing(em inglês)

[ODBMB2000-1] SMITH, A.. Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology. New York: Oxford University Press, 2000. 672 p.ISBN 978-0198506737

[B2008-2] GARRET, R. H.; GRISHAM, C. M.. Biochemistry. 4. ed. Massachusetts: Brooks Cole, 2008. 1184 p.ISBN 978-0495109358

[BFG2009-3] PEVSNER, J.. Bioinformatics and Functional Genomics. 2. ed. New Jersey: Wiley-Blackwell, 2009. 992 p.ISBN 978-0470085851

[DSP2001-4] GRAHAM, C. A.; HILL, A. J. M.. DNA Sequencing Protocols. 2. ed. New Jersey: Humana Press, 2001. 244 p.ISBN 978-0896037212

[KCATDM2005-5] KONEMAN, E. W.. Koneman's Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology. 6. ed. Maryland: Lippincott Williams & Wilkins, 2005. 1736 p.ISBN 978-0781730143

[PGMG2006-6] PRIMROSE, S. D.; TWYMAN, R.. Principles of Gene Manipulation and Genomics. 7. ed. Massachusetts: Wiley-Blackwell, 2006. 672 p.ISBN 978-1405135443

[MBB2009-7] WALKER, J. M.; RAPLEY, R.. Molecular Biology and Biotechnology. 5. ed. Cambridge: Royal Society of Chemistry, 2009. 604 p.ISBN 978-0854041251

[MBPARD2009-8] GLICK, B. R.; PASTERNAK, J. J.; PATTEN, C. L.. Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA. 4. ed. Washington: ASM Press, 2009. 1000 p.ISBN 978-1555814984

[NACB-9] BLACKBURN, G. M.; GAIT, M. J.; LOAKES, D. WILLIAMS, D.. Nucleic Acids in Chemistry and Biology. Cambridge: Royal Society of Chemistry, 2006. 586 p.ISBN 978-0854046546

[MSBS1996-10] BURLINGAME, A. L.; CARR, S. A.. Mass Spectrometry in the Biological Sciences. New Jersey: Humana Press, 1996. 570 p.ISBN 978-0896033405

[11] «Introduction».www.stenutz.eu.Consultado em 14 de abril de 2024

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