Tương đương đa đích đản bạch chất hành sử công năng đích thời hầu tịnh bất thị đan đả độc đấu đích, đản bạch chất môn thông quá đản bạch chất tương hỗ tác dụng hình thành phục hợp thể nhiên hậu tiến hành công tác. Nhân thử, nghiên cứu đản bạch chất đích tương hỗ tác dụng thành vi nghiên cứu đản bạch chất công năng hòa tác dụng cơ chế đích tối vi trọng yếu đích hoàn tiết chi nhất.
Nghiên cứu đản bạch hỗ tác đích phương pháp hữu ngận đa, kim thiên tiểu biên tựu kỉ chủng thường dụng đích phương pháp tố cá giản đan đích khái thuật, hi vọng năng cú bang trợ đáo đại gia.
1, diếu mẫu song tạp giao hệ thống
Nguyên lý: Ngận đa chân hạch sinh vật đích vị điểm đặc dị chuyển lục kích hoạt nhân tử thông thường cụ hữu lưỡng cá khả phân cát khai đích kết cấu vực, tức DNA đặc dị kết hợp vực ( DNA-binding domain, BD ) dữ chuyển lục kích hoạt vực ( Transcriptional activationdomain, AD ). Giá lưỡng cá kết cấu vực các cụ công năng, hỗ bất ảnh hưởng, đãn nhất cá hoàn chỉnh đích kích hoạt đặc định cơ nhân biểu đạt đích kích hoạt nhân tử tất tu đồng thời hàm hữu giá lưỡng cá kết cấu vực, phủ tắc vô pháp hoàn thành kích hoạt công năng.
Tương lưỡng đãi trắc nghiên cứu đản bạch ( đản bạch X dữ đản bạch Y ) phân biệt dữ BD, AD kết cấu vực cấu kiến dung hợp chất lạp. Tương cấu kiến hảo đích lưỡng cá chất lạp chuyển nhập đồng nhất diếu mẫu tế bào trung biểu đạt, như quả lưỡng đản bạch chi gian bất tồn tại tương hỗ tác dụng, tắc hạ du cơ nhân ( báo cáo cơ nhân ) bất hội chuyển lục biểu đạt; như quả lưỡng cá đản bạch tồn tại tương hỗ tác dụng, tắc BD dữ AD lưỡng kết cấu vực không gian thượng ngận tiếp cận, tòng nhi hạ du cơ nhân ( báo cáo cơ nhân ) đắc đáo chuyển lục. Phán đoạn thông quá báo cáo cơ nhân biểu đạt dữ phủ, tức khả phán đoạn lưỡng đản bạch chi gian thị phủ tồn tại tương hỗ tác dụng.
Dụng diếu mẫu song tạp giao hệ thống năng cú khoái tốc, trực tiếp phân tích dĩ tri đản bạch chi gian đích tương hỗ tác dụng, tịnh năng tầm trảo, phân ly dữ dĩ tri đản bạch tương hỗ tác dụng đích phối thể, tại nghiên cứu kháng nguyên hòa kháng thể tương hỗ tác dụng, phát hiện tân đích đản bạch chất hòa phát hiện đản bạch chất đích tân công năng, si tuyển dược vật tác dụng vị điểm cập dược vật đối đản bạch hỗ tác ảnh hưởng, kiến lập cơ nhân tổ đản bạch liên tỏa đồ đẳng phương diện ứng dụng quảng phiếm.
2, miễn dịch cộng trầm điến
Miễn dịch cộng trầm điến ( Co-Immunoprecipitation, Co-IP ) thị nhất chủng dĩ kháng thể hòa kháng nguyên chi gian đích chuyên nhất tính tác dụng vi cơ sở đích dụng vu nghiên cứu lưỡng cá đản bạch tương hỗ tác dụng đích kinh điển phương pháp.
Nguyên lý: Cơ vu kháng thể dữ kháng nguyên ( bá đản bạch ) chi gian đích đặc dị tính kết hợp, thử thời như quả dạng phẩm dung dịch trung tồn tại năng dữ bá đản bạch tương hỗ tác dụng đích mục đích đản bạch, hội nhất đồng bị lạp hạ lai, tùy hậu lợi dụng SDS-PAGE, Western Blot đẳng phương pháp đối đắc đáo đích mục tiêu đản bạch tiến hành phân tích, tiến nhi chứng minh lưỡng giả gian đích tương hỗ tác dụng.
Thông tục điểm lai thuyết, giả thiết ngã môn nhu yếu nghiên cứu dạng phẩm trung A đản bạch hòa B đản bạch chi gian thị phủ tồn tại nhất ta tương hỗ tác dụng, thủ tiên ngã môn thông quá hợp thích đích phương pháp xử lý dạng bổn, tương đản bạch đề thủ xuất lai ( đồng thời bất năng phá phôi đản bạch chi gian đích tương hỗ tác dụng ), nhiên hậu dụng dự tiên kết hợp liễu quỳnh chi đường châu hoặc giả từ châu đích A đản bạch kháng thể bộ hoạch dạng bổn trung đích A đản bạch, na ma dữ A đản bạch kết hợp đích B đản bạch dã năng nhất khởi trầm điến hạ lai. Tái tương đản bạch tòng châu tử thượng liệt giải hạ lai, đối B đản bạch tiến hành kiểm trắc, năng kiểm trắc đáo, thuyết minh B đản bạch tại chi tiền đích trầm điến quá trình trung tùy trứ A đản bạch nhất khởi bị lạp hạ lai liễu, tiến nhi chứng minh nhị giả chi gian tồn tại tương hỗ quan hệ.
( DOI: 10.1007/978-1-4939-7033-9_17 )
3, miễn dịch huỳnh quang cộng định vị
Tương miễn dịch học phương pháp ( kháng nguyên kháng thể đặc dị kết hợp ) dữ huỳnh quang tiêu ký kỹ thuật kết hợp khởi lai nghiên cứu đặc dị đản bạch kháng nguyên tại tế bào nội phân bố đích phương pháp. Nhất bàn dụng lai nghiệm chứng 2 chủng hoặc 3 chủng đản bạch thị phủ tồn tại cộng định vị quan hệ.
Do vu huỳnh quang tố sở phát đích huỳnh quang khả tại huỳnh quang hiển vi kính hạ kiểm xuất, tòng nhi khả đối kháng nguyên tiến hành tế bào định vị. Lưỡng chủng bất đồng đích đản bạch sử dụng bất đồng chúc tính đích bất đồng nhan sắc huỳnh quang tiêu ký hậu, thông quá quan sát nhan sắc đích biến hóa xác định thị phủ hữu cộng định vị, dã khả dĩ sử dụng nhuyễn kiện tiến hành phân tích.
Cai kỹ thuật đích chủ yếu đặc điểm thị: Đặc dị tính cường, mẫn cảm tính cao, tốc độ khoái. Chủ yếu khuyết điểm thị: Phi đặc dị tính nhiễm sắc vấn đề thượng vị hoàn toàn giải quyết, kết quả phán định đích khách quan tính bất túc, kỹ thuật trình tự dã hoàn bỉ giác phục tạp.
4, Pull-down thật nghiệm
Pull-down thật nghiệm, hựu xưng lạp hạ thật nghiệm, thị nhất chủng thể ngoại thân hòa thuần hóa kỹ thuật. ( giá cá thật nghiệm cân miễn dịch cộng trầm điến thật nghiệm ngận tượng, bất đồng đích thị miễn dịch cộng trầm điến thị tại tế bào lí tiến hành đích. )
Nguyên lý: Tương nhất chủng đản bạch chất cố định vu mỗ chủng cơ chất thượng ( như Sepharose ), đãn tế bào trừu đề dịch kinh quá cai cơ chất thời, khả dữ cai cố định đản bạch tương hỗ tác dụng đích phối thể đản bạch bị hấp phụ, nhi một hữu bị hấp phụ đích “Tạp chất” tắc tùy tẩy thoát dịch lưu xuất. Bị hấp phụ đích đản bạch khả dĩ thông quá cải biến tẩy thoát dịch hoặc tẩy thoát điều kiện nhi hồi thu hạ lai.
Vi liễu canh hữu hiệu địa lợi dụng pull down kỹ thuật, khả dĩ tương đãi thuần hóa đích đản bạch dĩ dung hợp đản bạch đích hình thức biểu đạt, tức tương “Dụ nhị” đản bạch dữ nhất chủng dịch vu thuần hóa đích phối thể đản bạch tương dung hợp. 1988 niên Smith đẳng lợi dụng cốc quang cam thái -S- chuyển di môi ( GST ) dung hợp tiêu thiêm tòng tế khuẩn trung nhất bộ thuần hóa xuất GST dung hợp đản bạch.
GST Pull-Down thật nghiệm: Lợi dụng DNA trọng tổ kỹ thuật tương dĩ tri đản bạch dữ GST dung hợp, nhi dung hợp đản bạch thông quá GST dữ cố hóa tại tái thể thượng đích GTH ( cốc quang cam thái ) thân hòa kết hợp. Giản đan lai thuyết, ngã môn giả định a đản bạch hòa b đản bạch khả năng tồn tại hỗ tác, tương thuần hóa đích dung hợp GST đích a đản bạch hòa thuần hóa đích b đản bạch dĩ cập năng đặc dị tính kết hợp GST đích Sephrose 4B beads hỗn hợp tại nhất khởi phu dục nhất định thời gian, nhiên hậu tẩy khứ vị kết hợp đích đản bạch, chử phí beads tiến hành SDS-PAGE điện vịnh. Thông quá Western blot kiểm trắc kết quả, ngã môn khả dĩ khán đáo GST-a đản bạch hòa b đản bạch sở đối ứng đích điều đái, tức biểu minh liễu a đản bạch hòa b đản bạch nhân phát sinh tương hỗ tác dụng nhi bị GST-a pull down ( GST đối chiếu chỉ hiển kỳ nhất cá điều đái ).
pull down kỹ thuật khả dụng vu nghiệm chứng dĩ tri đản bạch hoặc thái đích tương hỗ tác dụng, dã khả dĩ dụng lai si tuyển dữ dĩ tri đản bạch hoặc thái hỗ tác đích vị tri đản bạch hoặc thái. Đãn thị tại nhất định trình độ thượng bất năng chân thật phản ứng tế bào nội đản bạch chất chi gian đích tương hỗ tác dụng, nhân vi tại thể ngoại tương hỗ tác dụng đích đản bạch chất tại chính thường sinh lý điều kiện hạ bất nhất định hội tương hỗ kết hợp.
5, thân hòa thuần hóa chất phổ ( AP -MS )
AP-MS ( Affinity Purification coupled MS ), tức thân hòa thuần hóa xuyến liên chất phổ phân tích.
Nguyên lý: Cơ vu đặc dị tính kháng thể hoặc kỳ tha thân hòa thí tề dữ bá tiêu đản bạch đích thân hòa tác dụng, thông quá miễn dịch cộng trầm điến ( co-Immunoprecipitation ) tương bá tiêu đản bạch dữ bá tiêu đản bạch đích tương hỗ tác dụng đản bạch tòng phục tạp đích sinh vật thể hệ trung thuần hóa xuất lai, tiến nhi tiến hành chất phổ kiểm trắc dĩ giám định bá tiêu đản bạch đích tương hỗ tác dụng đản bạch.
Kinh điển đích AP-MS thật nghiệm thông thường bao hàm dĩ hạ 4 cá quan kiện bộ sậu: 1 ) tế bào hoặc tổ chức đích liệt giải; 2 ) đản bạch dung dịch dữ ngẫu liên kháng thể đích thân hòa vi châu đích phu dục; 3 ) phi đặc dị tính kết hợp hòa bối cảnh đản bạch đích thanh tẩy dĩ cập đặc dị tính hỗ tác đản bạch đích tẩy thoát; 4 ) hỗ tác đản bạch đích chất phổ kiểm trắc hòa phân tích.
6, song phân tử huỳnh quang hỗ bổ kỹ thuật
Song phân tử huỳnh quang hỗ bổ ( Bimolecular fluorescence complementation, BiFC ), cai kỹ thuật thị lợi dụng huỳnh quang đản bạch đích đặc điểm lai nghiên cứu đản bạch đích tương hỗ tác dụng.
Huỳnh quang đản bạch khả tòng đặc định đích vị điểm bị phân khai, sản sinh lưỡng cá phi huỳnh quang hoạt tính phiến đoạn tức N đoan phiến đoạn ( N-fragment ) hòa C đoan phiến đoạn ( C-fragment ) ( VN cập VC ). Đương lưỡng phiến đoạn phân biệt bị dung hợp đáo tương hỗ tác dụng đích đản bạch thượng thời, hội nhân đản bạch đích tương hỗ tác dụng lực nhi bị lạp cận, phát sinh hỗ bổ tòng nhi trọng tân cấu kiến thành hữu hoạt tính đích huỳnh quang đản bạch tịnh tại kích phát quang hạ sản sinh huỳnh quang. Nhân thử lợi dụng huỳnh quang hiển vi kính tựu khả dĩ trực tiếp thông quá quan sát huỳnh quang hữu vô lai phán đoạn đản bạch thị phủ phát sinh tương hỗ tác dụng.
Giá thị tại hoạt tế bào trung quan sát đản bạch tương hỗ tác dụng đích ngận hảo đích phương pháp.
Giá cá phương pháp hoàn thị tồn tại giả dương tính đích, tế bào lí đại lượng biểu đạt đích phân đoạn đích hoàng sắc huỳnh quang đản bạch ( YFP ) khả năng hội bất thụ nghiên cứu đản bạch đích kết hợp dữ phủ nhi tự kỷ kết hợp tại nhất khởi, sở dĩ âm tính đối chiếu đích sử dụng phi thường trọng yếu.
7, NanoBiT đản bạch hỗ bổ kỹ thuật
Thử phương pháp dữ BIFC đích tối đại khu biệt tại vu, BIFC sách phân đích thị YFP huỳnh quang đản bạch, NanoBiT sách phân đích thị huỳnh hỏa trùng huỳnh quang tố môi Luciferase. Huỳnh quang tố môi nhu yếu hữu để vật đích tồn tại, phát xuất đích thị tự phát huỳnh quang nhi phi kích phát quang. Giá loại kỹ thuật đích hảo xử thị khả dĩ tại hoạt tế bào lí tiến hành quan trắc, khả dĩ tiến hành thật thời giam khống, định lượng đẳng thật nghiệm.
Cai phương pháp lợi dụng phân tử sinh vật học phương pháp tương NanoBit đản bạch sách phân thành 17.6kDa đích LgBit hòa 11 cá an cơ toan đích SmBit, phân biệt tác vi đản bạch biểu đạt tái thể thượng diện đích lưỡng cá tiêu thiêm, đương lưỡng cá đản bạch khả dĩ phát sinh hỗ tác thời, LgBit hòa SmBit không gian cự ly lạp cận, kết cấu hỗ bổ hình thành hoàn chỉnh đích NanoBit đản bạch, tại để vật kiểm trắc hạ khả dĩ phát xuất ngận cường đích luminescent tín hào.
Do vu NanoBit đản bạch phân tử lượng tiểu, quang tín hào cường, biểu đạt hiệu suất cao, phi đặc dị tính tự phát quang bối cảnh đê, tịnh thả tiêu thiêm đản bạch kết hợp thị khả nghịch đích, sở dĩ giá cá phương pháp giác BIFC hữu ngận đa ưu thế.
Thử thật nghiệm tảo kỳ nhu yếu mạc tác LgBit hòa SmBit cấu kiến tại bất đồng đích N đoan hoặc C đoan đích tổ hợp.
8, huỳnh quang cộng chấn năng lượng chuyển di
Huỳnh quang cộng chấn năng lượng chuyển di ( Fluorescent Resonance Energy Transfer, FRET) thị nhất chủng thông quá huỳnh quang vật chất gian phát sinh phi phúc xạ năng lượng chuyển di tiến hành phân tích đích quang phổ phân tích pháp.
Đương cung thể huỳnh quang phân tử đích phát xạ quang phổ dữ thụ thể huỳnh quang phân tử đích hấp thu quang phổ trọng điệp, tịnh thả lưỡng cá phân tử đích cự ly tại 10nm phạm vi dĩ nội thời, tựu hội phát sinh nhất chủng phi phóng xạ tính đích năng lượng chuyển di, tức FRET hiện tượng, sử đắc cung thể đích huỳnh quang cường độ bỉ tha đan độc tồn tại thời yếu đê đích đa ( huỳnh quang thốt diệt ), nhi thụ thể phát xạ đích huỳnh quang khước đại đại tăng cường ( mẫn hóa huỳnh quang ).
Thanh sắc huỳnh quang đản bạch ( cyan fluorescent protein, CFP ), hoàng sắc huỳnh quang đản bạch ( yellow fluorescent protein, YFP ) vi mục tiền đản bạch - đản bạch tương hỗ tác dụng nghiên cứu trung tối quảng phiếm ứng dụng đích FRET đối.
Giá hạng kỹ thuật bất cận năng nghiệm chứng đản bạch chất đích tương hỗ tác dụng, hoàn năng cú biểu chinh giá chủng tương hỗ tác dụng cự ly đích động thái biến hóa, bỉ như đản bạch chất phân tử trực tiếp tương đối vận động đích phương hướng tốc độ đẳng.
9, sinh vật phát quang năng lượng cộng chấn chuyển di (BRET)
Dụng sinh vật phát quang đản bạch thế đại huỳnh quang cung thể, bất y lại vu kích phát quang, kiểm trắc bối cảnh đê.
Tại BRET kỹ thuật trung, đản bạch A dung hợp huỳnh quang tố môi ( thông thường thị hải thận huỳnh quang tố môi ), tác vi năng lượng cung thể, đản bạch B dung hợp đái hữu huỳnh quang cơ đoàn đích tiêu thiêm đản bạch, tác vi năng lượng thụ thể, như quả đản bạch A, B tồn tại tương hỗ tác dụng thời, gia nhập huỳnh quang tố môi để vật hậu, huỳnh quang tố môi phát quang khả dĩ kích phát lâm cận đích đản bạch B đích huỳnh quang cơ đoàn phát quang, thông quá kiểm trắc huỳnh quang hòa phát quang tín hào bỉ trị, lai kiểm trắc đản bạch tương hỗ tác dụng. Như quả đản bạch A hòa B vô tương hỗ tác dụng, huỳnh quang tố môi phát quang đích năng lượng tương vô pháp truyện đệ đáo thụ thể đản bạch, tòng nhi thụ thể đản bạch bất hội bị kích phát sản sinh huỳnh quang tín hào.
Giá cá phương pháp dữ FRET tương bỉ, dụng sinh vật phát quang đản bạch thế đại huỳnh quang cung thể, bất y lại vu kích phát quang, kiểm trắc bối cảnh đê; bất nhu yếu phiêu bạch, tế bào tổn phôi canh thiếu; đồng thời dã tị miễn liễu tự phát huỳnh quang càn nhiễu; tác vi cung thể đích NanoLuc huỳnh quang tố môi đản bạch phân tử lượng tiểu, canh thích hợp dung hợp đản bạch biểu đạt cấu kiến, tịnh thả quang tín hào cường.
Đãn thị, tha nhu yếu phối đối đích để vật, tịnh thả giá cá để vật hoàn bất tiện nghi, nhu yếu đại lượng sử dụng đích thoại yếu khảo lự hảo kinh tế vấn đề.
10, DUOLINK thật nghiệm
Duolink thật nghiệm cơ vu lân vị liên tiếp kỹ thuật (proximity ligation assay, PLA), đương nhất đối PLA probes túc cú tiếp cận thời ( tiểu vu 40 nm) hội sản sinh PLA tín hào, do vu PLA probes đặc dị thức biệt nhất kháng, PLA tín hào đích cường nhược trực tiếp phản ánh liễu đản bạch biểu đạt lượng thủy bình hoặc đản bạch hỗ tác đích cường độ.
Lợi dụng huỳnh quang hiển vi kính khả dĩ quan sát đáo PLA tín hào cập kỳ vị trí, thông quá DuolinkImageTool khả dĩ tiến hành tinh xác đích định lượng hòa biểu đạt soa dị đẳng phân tích. Duolink thật nghiệm năng đồng thời thật hiện đối đản bạch - đản bạch hỗ tác, đản bạch biểu đạt hoặc đản bạch phiên dịch hậu tu sức tiến hành định vị, định lượng hòa kiểm trắc.
Thông quá Duolink kỹ thuật, khả tương đản bạch tín hào phóng đại 1000 bội, nhục nhãn tức khả kiểm trắc đản bạch cập kỳ hỗ tác, thả chỉnh cá thật nghiệm phương án giản đan trực tiếp.
Nghiên cứu đản bạch hỗ tác đích phương pháp hữu ngận đa, kim thiên tiểu biên tựu kỉ chủng thường dụng đích phương pháp tố cá giản đan đích khái thuật, hi vọng năng cú bang trợ đáo đại gia.
1, diếu mẫu song tạp giao hệ thống
Nguyên lý: Ngận đa chân hạch sinh vật đích vị điểm đặc dị chuyển lục kích hoạt nhân tử thông thường cụ hữu lưỡng cá khả phân cát khai đích kết cấu vực, tức DNA đặc dị kết hợp vực ( DNA-binding domain, BD ) dữ chuyển lục kích hoạt vực ( Transcriptional activationdomain, AD ). Giá lưỡng cá kết cấu vực các cụ công năng, hỗ bất ảnh hưởng, đãn nhất cá hoàn chỉnh đích kích hoạt đặc định cơ nhân biểu đạt đích kích hoạt nhân tử tất tu đồng thời hàm hữu giá lưỡng cá kết cấu vực, phủ tắc vô pháp hoàn thành kích hoạt công năng.
Tương lưỡng đãi trắc nghiên cứu đản bạch ( đản bạch X dữ đản bạch Y ) phân biệt dữ BD, AD kết cấu vực cấu kiến dung hợp chất lạp. Tương cấu kiến hảo đích lưỡng cá chất lạp chuyển nhập đồng nhất diếu mẫu tế bào trung biểu đạt, như quả lưỡng đản bạch chi gian bất tồn tại tương hỗ tác dụng, tắc hạ du cơ nhân ( báo cáo cơ nhân ) bất hội chuyển lục biểu đạt; như quả lưỡng cá đản bạch tồn tại tương hỗ tác dụng, tắc BD dữ AD lưỡng kết cấu vực không gian thượng ngận tiếp cận, tòng nhi hạ du cơ nhân ( báo cáo cơ nhân ) đắc đáo chuyển lục. Phán đoạn thông quá báo cáo cơ nhân biểu đạt dữ phủ, tức khả phán đoạn lưỡng đản bạch chi gian thị phủ tồn tại tương hỗ tác dụng.
Dụng diếu mẫu song tạp giao hệ thống năng cú khoái tốc, trực tiếp phân tích dĩ tri đản bạch chi gian đích tương hỗ tác dụng, tịnh năng tầm trảo, phân ly dữ dĩ tri đản bạch tương hỗ tác dụng đích phối thể, tại nghiên cứu kháng nguyên hòa kháng thể tương hỗ tác dụng, phát hiện tân đích đản bạch chất hòa phát hiện đản bạch chất đích tân công năng, si tuyển dược vật tác dụng vị điểm cập dược vật đối đản bạch hỗ tác ảnh hưởng, kiến lập cơ nhân tổ đản bạch liên tỏa đồ đẳng phương diện ứng dụng quảng phiếm.
2, miễn dịch cộng trầm điến
Miễn dịch cộng trầm điến ( Co-Immunoprecipitation, Co-IP ) thị nhất chủng dĩ kháng thể hòa kháng nguyên chi gian đích chuyên nhất tính tác dụng vi cơ sở đích dụng vu nghiên cứu lưỡng cá đản bạch tương hỗ tác dụng đích kinh điển phương pháp.
Nguyên lý: Cơ vu kháng thể dữ kháng nguyên ( bá đản bạch ) chi gian đích đặc dị tính kết hợp, thử thời như quả dạng phẩm dung dịch trung tồn tại năng dữ bá đản bạch tương hỗ tác dụng đích mục đích đản bạch, hội nhất đồng bị lạp hạ lai, tùy hậu lợi dụng SDS-PAGE, Western Blot đẳng phương pháp đối đắc đáo đích mục tiêu đản bạch tiến hành phân tích, tiến nhi chứng minh lưỡng giả gian đích tương hỗ tác dụng.
Thông tục điểm lai thuyết, giả thiết ngã môn nhu yếu nghiên cứu dạng phẩm trung A đản bạch hòa B đản bạch chi gian thị phủ tồn tại nhất ta tương hỗ tác dụng, thủ tiên ngã môn thông quá hợp thích đích phương pháp xử lý dạng bổn, tương đản bạch đề thủ xuất lai ( đồng thời bất năng phá phôi đản bạch chi gian đích tương hỗ tác dụng ), nhiên hậu dụng dự tiên kết hợp liễu quỳnh chi đường châu hoặc giả từ châu đích A đản bạch kháng thể bộ hoạch dạng bổn trung đích A đản bạch, na ma dữ A đản bạch kết hợp đích B đản bạch dã năng nhất khởi trầm điến hạ lai. Tái tương đản bạch tòng châu tử thượng liệt giải hạ lai, đối B đản bạch tiến hành kiểm trắc, năng kiểm trắc đáo, thuyết minh B đản bạch tại chi tiền đích trầm điến quá trình trung tùy trứ A đản bạch nhất khởi bị lạp hạ lai liễu, tiến nhi chứng minh nhị giả chi gian tồn tại tương hỗ quan hệ.
( DOI: 10.1007/978-1-4939-7033-9_17 )
3, miễn dịch huỳnh quang cộng định vị
Tương miễn dịch học phương pháp ( kháng nguyên kháng thể đặc dị kết hợp ) dữ huỳnh quang tiêu ký kỹ thuật kết hợp khởi lai nghiên cứu đặc dị đản bạch kháng nguyên tại tế bào nội phân bố đích phương pháp. Nhất bàn dụng lai nghiệm chứng 2 chủng hoặc 3 chủng đản bạch thị phủ tồn tại cộng định vị quan hệ.
Do vu huỳnh quang tố sở phát đích huỳnh quang khả tại huỳnh quang hiển vi kính hạ kiểm xuất, tòng nhi khả đối kháng nguyên tiến hành tế bào định vị. Lưỡng chủng bất đồng đích đản bạch sử dụng bất đồng chúc tính đích bất đồng nhan sắc huỳnh quang tiêu ký hậu, thông quá quan sát nhan sắc đích biến hóa xác định thị phủ hữu cộng định vị, dã khả dĩ sử dụng nhuyễn kiện tiến hành phân tích.
Cai kỹ thuật đích chủ yếu đặc điểm thị: Đặc dị tính cường, mẫn cảm tính cao, tốc độ khoái. Chủ yếu khuyết điểm thị: Phi đặc dị tính nhiễm sắc vấn đề thượng vị hoàn toàn giải quyết, kết quả phán định đích khách quan tính bất túc, kỹ thuật trình tự dã hoàn bỉ giác phục tạp.
4, Pull-down thật nghiệm
Pull-down thật nghiệm, hựu xưng lạp hạ thật nghiệm, thị nhất chủng thể ngoại thân hòa thuần hóa kỹ thuật. ( giá cá thật nghiệm cân miễn dịch cộng trầm điến thật nghiệm ngận tượng, bất đồng đích thị miễn dịch cộng trầm điến thị tại tế bào lí tiến hành đích. )
Nguyên lý: Tương nhất chủng đản bạch chất cố định vu mỗ chủng cơ chất thượng ( như Sepharose ), đãn tế bào trừu đề dịch kinh quá cai cơ chất thời, khả dữ cai cố định đản bạch tương hỗ tác dụng đích phối thể đản bạch bị hấp phụ, nhi một hữu bị hấp phụ đích “Tạp chất” tắc tùy tẩy thoát dịch lưu xuất. Bị hấp phụ đích đản bạch khả dĩ thông quá cải biến tẩy thoát dịch hoặc tẩy thoát điều kiện nhi hồi thu hạ lai.
Vi liễu canh hữu hiệu địa lợi dụng pull down kỹ thuật, khả dĩ tương đãi thuần hóa đích đản bạch dĩ dung hợp đản bạch đích hình thức biểu đạt, tức tương “Dụ nhị” đản bạch dữ nhất chủng dịch vu thuần hóa đích phối thể đản bạch tương dung hợp. 1988 niên Smith đẳng lợi dụng cốc quang cam thái -S- chuyển di môi ( GST ) dung hợp tiêu thiêm tòng tế khuẩn trung nhất bộ thuần hóa xuất GST dung hợp đản bạch.
GST Pull-Down thật nghiệm: Lợi dụng DNA trọng tổ kỹ thuật tương dĩ tri đản bạch dữ GST dung hợp, nhi dung hợp đản bạch thông quá GST dữ cố hóa tại tái thể thượng đích GTH ( cốc quang cam thái ) thân hòa kết hợp. Giản đan lai thuyết, ngã môn giả định a đản bạch hòa b đản bạch khả năng tồn tại hỗ tác, tương thuần hóa đích dung hợp GST đích a đản bạch hòa thuần hóa đích b đản bạch dĩ cập năng đặc dị tính kết hợp GST đích Sephrose 4B beads hỗn hợp tại nhất khởi phu dục nhất định thời gian, nhiên hậu tẩy khứ vị kết hợp đích đản bạch, chử phí beads tiến hành SDS-PAGE điện vịnh. Thông quá Western blot kiểm trắc kết quả, ngã môn khả dĩ khán đáo GST-a đản bạch hòa b đản bạch sở đối ứng đích điều đái, tức biểu minh liễu a đản bạch hòa b đản bạch nhân phát sinh tương hỗ tác dụng nhi bị GST-a pull down ( GST đối chiếu chỉ hiển kỳ nhất cá điều đái ).
pull down kỹ thuật khả dụng vu nghiệm chứng dĩ tri đản bạch hoặc thái đích tương hỗ tác dụng, dã khả dĩ dụng lai si tuyển dữ dĩ tri đản bạch hoặc thái hỗ tác đích vị tri đản bạch hoặc thái. Đãn thị tại nhất định trình độ thượng bất năng chân thật phản ứng tế bào nội đản bạch chất chi gian đích tương hỗ tác dụng, nhân vi tại thể ngoại tương hỗ tác dụng đích đản bạch chất tại chính thường sinh lý điều kiện hạ bất nhất định hội tương hỗ kết hợp.
5, thân hòa thuần hóa chất phổ ( AP -MS )
AP-MS ( Affinity Purification coupled MS ), tức thân hòa thuần hóa xuyến liên chất phổ phân tích.
Nguyên lý: Cơ vu đặc dị tính kháng thể hoặc kỳ tha thân hòa thí tề dữ bá tiêu đản bạch đích thân hòa tác dụng, thông quá miễn dịch cộng trầm điến ( co-Immunoprecipitation ) tương bá tiêu đản bạch dữ bá tiêu đản bạch đích tương hỗ tác dụng đản bạch tòng phục tạp đích sinh vật thể hệ trung thuần hóa xuất lai, tiến nhi tiến hành chất phổ kiểm trắc dĩ giám định bá tiêu đản bạch đích tương hỗ tác dụng đản bạch.
Kinh điển đích AP-MS thật nghiệm thông thường bao hàm dĩ hạ 4 cá quan kiện bộ sậu: 1 ) tế bào hoặc tổ chức đích liệt giải; 2 ) đản bạch dung dịch dữ ngẫu liên kháng thể đích thân hòa vi châu đích phu dục; 3 ) phi đặc dị tính kết hợp hòa bối cảnh đản bạch đích thanh tẩy dĩ cập đặc dị tính hỗ tác đản bạch đích tẩy thoát; 4 ) hỗ tác đản bạch đích chất phổ kiểm trắc hòa phân tích.
6, song phân tử huỳnh quang hỗ bổ kỹ thuật
Song phân tử huỳnh quang hỗ bổ ( Bimolecular fluorescence complementation, BiFC ), cai kỹ thuật thị lợi dụng huỳnh quang đản bạch đích đặc điểm lai nghiên cứu đản bạch đích tương hỗ tác dụng.
Huỳnh quang đản bạch khả tòng đặc định đích vị điểm bị phân khai, sản sinh lưỡng cá phi huỳnh quang hoạt tính phiến đoạn tức N đoan phiến đoạn ( N-fragment ) hòa C đoan phiến đoạn ( C-fragment ) ( VN cập VC ). Đương lưỡng phiến đoạn phân biệt bị dung hợp đáo tương hỗ tác dụng đích đản bạch thượng thời, hội nhân đản bạch đích tương hỗ tác dụng lực nhi bị lạp cận, phát sinh hỗ bổ tòng nhi trọng tân cấu kiến thành hữu hoạt tính đích huỳnh quang đản bạch tịnh tại kích phát quang hạ sản sinh huỳnh quang. Nhân thử lợi dụng huỳnh quang hiển vi kính tựu khả dĩ trực tiếp thông quá quan sát huỳnh quang hữu vô lai phán đoạn đản bạch thị phủ phát sinh tương hỗ tác dụng.
Giá thị tại hoạt tế bào trung quan sát đản bạch tương hỗ tác dụng đích ngận hảo đích phương pháp.
Giá cá phương pháp hoàn thị tồn tại giả dương tính đích, tế bào lí đại lượng biểu đạt đích phân đoạn đích hoàng sắc huỳnh quang đản bạch ( YFP ) khả năng hội bất thụ nghiên cứu đản bạch đích kết hợp dữ phủ nhi tự kỷ kết hợp tại nhất khởi, sở dĩ âm tính đối chiếu đích sử dụng phi thường trọng yếu.
7, NanoBiT đản bạch hỗ bổ kỹ thuật
Thử phương pháp dữ BIFC đích tối đại khu biệt tại vu, BIFC sách phân đích thị YFP huỳnh quang đản bạch, NanoBiT sách phân đích thị huỳnh hỏa trùng huỳnh quang tố môi Luciferase. Huỳnh quang tố môi nhu yếu hữu để vật đích tồn tại, phát xuất đích thị tự phát huỳnh quang nhi phi kích phát quang. Giá loại kỹ thuật đích hảo xử thị khả dĩ tại hoạt tế bào lí tiến hành quan trắc, khả dĩ tiến hành thật thời giam khống, định lượng đẳng thật nghiệm.
Cai phương pháp lợi dụng phân tử sinh vật học phương pháp tương NanoBit đản bạch sách phân thành 17.6kDa đích LgBit hòa 11 cá an cơ toan đích SmBit, phân biệt tác vi đản bạch biểu đạt tái thể thượng diện đích lưỡng cá tiêu thiêm, đương lưỡng cá đản bạch khả dĩ phát sinh hỗ tác thời, LgBit hòa SmBit không gian cự ly lạp cận, kết cấu hỗ bổ hình thành hoàn chỉnh đích NanoBit đản bạch, tại để vật kiểm trắc hạ khả dĩ phát xuất ngận cường đích luminescent tín hào.
Do vu NanoBit đản bạch phân tử lượng tiểu, quang tín hào cường, biểu đạt hiệu suất cao, phi đặc dị tính tự phát quang bối cảnh đê, tịnh thả tiêu thiêm đản bạch kết hợp thị khả nghịch đích, sở dĩ giá cá phương pháp giác BIFC hữu ngận đa ưu thế.
Thử thật nghiệm tảo kỳ nhu yếu mạc tác LgBit hòa SmBit cấu kiến tại bất đồng đích N đoan hoặc C đoan đích tổ hợp.
8, huỳnh quang cộng chấn năng lượng chuyển di
Huỳnh quang cộng chấn năng lượng chuyển di ( Fluorescent Resonance Energy Transfer, FRET) thị nhất chủng thông quá huỳnh quang vật chất gian phát sinh phi phúc xạ năng lượng chuyển di tiến hành phân tích đích quang phổ phân tích pháp.
Đương cung thể huỳnh quang phân tử đích phát xạ quang phổ dữ thụ thể huỳnh quang phân tử đích hấp thu quang phổ trọng điệp, tịnh thả lưỡng cá phân tử đích cự ly tại 10nm phạm vi dĩ nội thời, tựu hội phát sinh nhất chủng phi phóng xạ tính đích năng lượng chuyển di, tức FRET hiện tượng, sử đắc cung thể đích huỳnh quang cường độ bỉ tha đan độc tồn tại thời yếu đê đích đa ( huỳnh quang thốt diệt ), nhi thụ thể phát xạ đích huỳnh quang khước đại đại tăng cường ( mẫn hóa huỳnh quang ).
Thanh sắc huỳnh quang đản bạch ( cyan fluorescent protein, CFP ), hoàng sắc huỳnh quang đản bạch ( yellow fluorescent protein, YFP ) vi mục tiền đản bạch - đản bạch tương hỗ tác dụng nghiên cứu trung tối quảng phiếm ứng dụng đích FRET đối.
Giá hạng kỹ thuật bất cận năng nghiệm chứng đản bạch chất đích tương hỗ tác dụng, hoàn năng cú biểu chinh giá chủng tương hỗ tác dụng cự ly đích động thái biến hóa, bỉ như đản bạch chất phân tử trực tiếp tương đối vận động đích phương hướng tốc độ đẳng.
9, sinh vật phát quang năng lượng cộng chấn chuyển di (BRET)
Dụng sinh vật phát quang đản bạch thế đại huỳnh quang cung thể, bất y lại vu kích phát quang, kiểm trắc bối cảnh đê.
Tại BRET kỹ thuật trung, đản bạch A dung hợp huỳnh quang tố môi ( thông thường thị hải thận huỳnh quang tố môi ), tác vi năng lượng cung thể, đản bạch B dung hợp đái hữu huỳnh quang cơ đoàn đích tiêu thiêm đản bạch, tác vi năng lượng thụ thể, như quả đản bạch A, B tồn tại tương hỗ tác dụng thời, gia nhập huỳnh quang tố môi để vật hậu, huỳnh quang tố môi phát quang khả dĩ kích phát lâm cận đích đản bạch B đích huỳnh quang cơ đoàn phát quang, thông quá kiểm trắc huỳnh quang hòa phát quang tín hào bỉ trị, lai kiểm trắc đản bạch tương hỗ tác dụng. Như quả đản bạch A hòa B vô tương hỗ tác dụng, huỳnh quang tố môi phát quang đích năng lượng tương vô pháp truyện đệ đáo thụ thể đản bạch, tòng nhi thụ thể đản bạch bất hội bị kích phát sản sinh huỳnh quang tín hào.
Giá cá phương pháp dữ FRET tương bỉ, dụng sinh vật phát quang đản bạch thế đại huỳnh quang cung thể, bất y lại vu kích phát quang, kiểm trắc bối cảnh đê; bất nhu yếu phiêu bạch, tế bào tổn phôi canh thiếu; đồng thời dã tị miễn liễu tự phát huỳnh quang càn nhiễu; tác vi cung thể đích NanoLuc huỳnh quang tố môi đản bạch phân tử lượng tiểu, canh thích hợp dung hợp đản bạch biểu đạt cấu kiến, tịnh thả quang tín hào cường.
Đãn thị, tha nhu yếu phối đối đích để vật, tịnh thả giá cá để vật hoàn bất tiện nghi, nhu yếu đại lượng sử dụng đích thoại yếu khảo lự hảo kinh tế vấn đề.
10, DUOLINK thật nghiệm
Duolink thật nghiệm cơ vu lân vị liên tiếp kỹ thuật (proximity ligation assay, PLA), đương nhất đối PLA probes túc cú tiếp cận thời ( tiểu vu 40 nm) hội sản sinh PLA tín hào, do vu PLA probes đặc dị thức biệt nhất kháng, PLA tín hào đích cường nhược trực tiếp phản ánh liễu đản bạch biểu đạt lượng thủy bình hoặc đản bạch hỗ tác đích cường độ.
Lợi dụng huỳnh quang hiển vi kính khả dĩ quan sát đáo PLA tín hào cập kỳ vị trí, thông quá DuolinkImageTool khả dĩ tiến hành tinh xác đích định lượng hòa biểu đạt soa dị đẳng phân tích. Duolink thật nghiệm năng đồng thời thật hiện đối đản bạch - đản bạch hỗ tác, đản bạch biểu đạt hoặc đản bạch phiên dịch hậu tu sức tiến hành định vị, định lượng hòa kiểm trắc.
Thông quá Duolink kỹ thuật, khả tương đản bạch tín hào phóng đại 1000 bội, nhục nhãn tức khả kiểm trắc đản bạch cập kỳ hỗ tác, thả chỉnh cá thật nghiệm phương án giản đan trực tiếp.