Thực vật tổ chức protein lấy ra phương pháp
1, căn cứ hàng mẫu trọng lượng (1g hàng mẫu gia nhập 3.5ml lấy ra dịch, nhưng căn cứ tài liệu bất đồng thích hợp gia nhập ), chuẩn
Bị lấy ra dịch đặt ở băng thượng.
2, đem hàng mẫu đặt ở nghiên bát có ích nitơ lỏng nghiền nát, nghiền nát sau gia nhập lấy ra dịch trung ở băng thượng tĩnh trí (3-4 giờ ).
3, dùng ly tâm cơ ly tâm 8000rpm40min4℃ hoặc 11100rpm20min4℃
4, lấy ra thượng đêm khuya tĩnh lặng, hàng mẫu chế bị hoàn thành.
Protein lấy ra dịch:300ml
1, 1Mtris-HCl(PH8) 45ml
2, cam du (Glycerol)75ml
3, Povidone (Polyvinylpolypyrrordone)6g
Loại này phương pháp nhằm vào SDS-PAGE, vuông góc bản điện vịnh!
Hoặc là dùng tam Clo dấm chua — aceton lắng đọng lại pháp, loại này phương pháp nhằm vào song hướng điện vịnh, tạp chất thiếu, ly tử độ dày tiểu nhân đặc điểm! Đương nhiên đơn hướng điện vịnh cũng đồng dạng áp dụng, chỉ là điện vịnh điều mang sẽ giảm bớt!
1, ở nitơ lỏng trung nghiền nát phiến lá
2, gia nhập hàng mẫu thể tích 3 lần lấy ra dịch ở -20℃ điều kiện hạ qua đêm, sau đó ly tâm (4℃8000rpm
Trở lên 1 giờ ) bỏ thượng thanh.
3, gia nhập chờ thể tích băng tắm aceton ( hàm 0.07% β- khưu cơ etanol ), diêu đều sau ly tâm (4℃8000rpm
Trở lên 1 giờ ), sau đó chân không khô ráo lắng đọng lại, dự phòng.
4, thượng dạng trước gia nhập phân tách dịch, nhiệt độ phòng đặt 30 phút, sử lòng trắng trứng đầy đủ hòa tan phân tách dịch trung, sau đó ly tâm
(15℃8000rpm trở lên 1 giờ hoặc càng dài thời gian lấy không có lắng đọng lại vì tiêu chuẩn ), nhưng lâm thời bảo tồn ở 4℃
Đãi dùng.
5, dùng Brandford pháp định lượng lòng trắng trứng, sau đó nhưng lô hàng để vào -80℃ dự phòng.
Dược phẩm:
Lấy ra dịch: Hàm 10%TCA cùng 0.07% β- khưu cơ etanol aceton
Phân tách dịch:2.7g phân u-rê 0.2gCHAPS hòa tan 3ml diệt khuẩn đi ly tử trong nước ( chung thể tích vì 5ml),
Sử dụng trước lại gia nhập 1M DTT65ul/ml
Tổ chức: Tràng niêm mạc vì lệ
Ứng dụng TRIPURE lấy ra protein bước đi:
Hàm protein thượng thanh dịch trung gia nhập dị Bính thuần:(1.5ml mỗi 1mlTRIPURE dùng lượng )
Đảo ngược hỗn đều, trí nhiệt độ phòng 10min
Ly tâm:12000 g,10min,4 độ, bỏ thượng thanh
Gia nhập 0.3M axit clohidric qua /95% etanol:(2ml mỗi 1mlTRIPURE dùng lượng )
Chấn động, trí nhiệt độ phòng 20min
Ly tâm: 7500g,5 min,4 độ, bỏ thượng thanh
Lặp lại 0.3M axit clohidric qua /95% etanol bước 2 thứ
Lắng đọng lại trung gia nhập 100% etanol 2ml
Đầy đủ chấn động hỗn đều, trí nhiệt độ phòng 20 min
Ly tâm: 7500g,5min,4 độ, bỏ thượng thanh làm khô lắng đọng lại
1%SDS hòa tan lắng đọng lại
Ly tâm:10000g,10min,4 độ
Lấy thượng thanh -20 độ bảo tồn ( hoặc nhưng trực tiếp dùng cho WESTERN BLOT)
Tồn tại vấn đề: Gia nhập 1%SDS sau lắng đọng lại không hòa tan, vẫn là rất lớn một khối,4 độ ly tâm sau lại nhiều
Màu trắng trầm định,SDS kết tinh? Trắc độ dày, hàm lượng mới 1mg/ml tả hữu.
Giải quyết: Đề lòng trắng trứng thuốc thử hộp, mặt khác tổ chức lớn nhỏ vừa phải, muốn toái, lập tức thêm 2X BUFFER, sau đó nấu
5-10 phút, hiệu quả thực tốt.
Vi khuẩn lòng trắng trứng
Dùng metanol lấy ra, ướp lạnh và làm khô sử dụng sau này giảm xóc dịch hòa tan. Hàng mẫu giảm xóc dịch là giống nhau. Trong đó hàm lại 2%
SDS,20mmol 2- khưu cơ etanol
U tổ chức
0-4°C nước muối sinh lí súc rửa tổ chức mặt ngoài vết máu, lấy 1:9( tức 100ug trọng lượng gia nhập 900ul thể tích )
Tỉ lệ gia nhập lòng trắng trứng đều tương lấy ra dịch,0-4 °C băng thủy hỗn hợp vật có ích 1ml đều tương khí chế thành 10% trứng
Bạch đều tương. Đều tương ở 10000G ly tâm 10-15 phút, lấy thượng thanh dự phòng.
Chú: Lòng trắng trứng đều tương lấy ra dịch (PH7.6):Nacl 50 mM Tris 10mM EDTA 1mM, PMSF 1 mM,
Na3 VO4.12H2O 0.5 mM NaF 50 mM Benzamidine 1 mM
Não tổ chức
Đem thiết lấy tổ chức dùng 4℃ dự lãnh 0.01mol/l PBS tẩy trắng đi vết máu, lại dùng giấy lọc hút khô tàn lưu
PBS, đem tổ chức cân nặng, đem 0.1G tổ chức để vào 1ml pha lê đều tương khí, gia nhập 800l phân tách dịch ở băng
Thượng đầy đủ đều tương, đem được đến đều huyết thanh dùng nitơ lỏng lặp lại đông lạnh dung 3 thứ, nhiệt độ phòng tĩnh trí 30mins,4℃
15000r/min ly tâm 1h, tiểu tâm tránh đi chi tầng, hấp thụ thượng thanh, lô hàng,-80℃ bảo tồn.
Phân tách dịch phối phương như sau:
Phân u-rê 7mol/l
Lưu niệu 2mol/l
CHAPS 4%(m/v)
DTT 65Mmol/L( thượng dạng trước lâm thêm )
IPG Buffer 0.5%(V/V)( thượng dạng trước lâm thêm )
PMSF 2ug/l(m/V)( thượng dạng trước lâm thêm )
DNA môi 1 2ug/l(m/V)( thượng dạng trước lâm thêm )
RNA môi A 2ug/l(m/V)( thượng dạng trước lâm thêm )
Con men lòng trắng trứng lấy ra phương pháp
1 chuẩn bị SD/-Leu hoặc là YPD môi trường nuôi cấy 20ml, con men qua đêm bồi dưỡng,30℃,230rpm.
2 trắc OD600 ước 1.0.
3 100ml qua đêm bồi dưỡng vật,1000g, ly tâm,5min,4℃.
4 bỏ thượng thanh, trọng huyền với 80ul trừu đề buffer:
0.1M Tris-Cl(PH7.5),0.2M NaCl,0.01Mβ-ME,20% cam du,5mM EDTA,1mM
PMSF. (100×):PMSF 0.1742g hòa tan 10ml dị mậu thuần ( chủ yếu ức chế ti Amonia toan lòng trắng trứng men kích thích ),
RT bảo tồn.
5 dời đi thượng thanh đến một dự lãnh pha lê quản trung, lại gia nhập pha lê châu 33ul(425-600um). Băng thượng thao tác,
Dòng xoáy 10min, nhưng không bao gồm hàng mẫu dự lãnh thời gian.
6 thu về pha lê châu, cũng tận khả năng lấy thượng thanh đến một khác dự lãnh pha lê quản trung.
7 40ul trừu đề buffer, giống như trên dòng xoáy.
8 ly tâm sau chia lìa thượng thanh ( thu về pha lê châu ).
9 nitơ lỏng nhanh chóng đông lạnh,-70℃ chứa đựng.