Khá nhiều protein hành sử công năng thời điểm cũng không phải đơn đả độc đấu, protein nhóm thông qua protein hỗ trợ lẫn nhau hình thành hợp lại thể sau đó tiến hành công tác. Bởi vậy, nghiên cứu protein hỗ trợ lẫn nhau trở thành nghiên cứu protein công năng cùng tác dụng cơ chế nhất quan trọng phân đoạn chi nhất.
Nghiên cứu lòng trắng trứng lẫn nhau làm phương pháp có rất nhiều, hôm nay tiểu biên liền vài loại thường dùng phương pháp làm đơn giản tường thuật tóm lược, hy vọng có thể trợ giúp đến đại gia.
1, con men song tạp giao hệ thống
Nguyên lý: Rất nhiều thật hạch sinh vật vị điểm đặc dị sang băng kích hoạt ước số thông thường có hai cái nhưng phân cách khai kết cấu vực, tức DNA đặc dị kết hợp vực ( DNA-binding domain, BD ) cùng sang băng kích hoạt vực ( Transcriptional activationdomain, AD ). Này hai cái kết cấu vực các cụ công năng, lẫn nhau không ảnh hưởng, nhưng một cái hoàn chỉnh kích hoạt riêng gien biểu đạt kích hoạt ước số cần thiết đồng thời đựng này hai cái kết cấu vực, nếu không vô pháp hoàn thành kích hoạt công năng.
Đem hai đãi trắc nghiên cứu lòng trắng trứng ( lòng trắng trứng X cùng lòng trắng trứng Y ) phân biệt cùng BD, AD kết cấu vực xây dựng dung hợp chất viên. Đem xây dựng tốt hai cái chất viên chuyển nhập cùng con men tế bào trung biểu đạt, nếu hai lòng trắng trứng chi gian không tồn tại hỗ trợ lẫn nhau, tắc hạ du gien ( báo cáo gien ) sẽ không sang băng biểu đạt; nếu hai cái lòng trắng trứng tồn tại hỗ trợ lẫn nhau, tắc BD cùng AD hai kết cấu vực không gian thượng thực tiếp cận, do đó hạ du gien ( báo cáo gien ) được đến sang băng. Phán đoán thông qua báo cáo gien biểu đạt cùng không, có thể phán đoán hai lòng trắng trứng chi gian hay không tồn tại hỗ trợ lẫn nhau.
Dùng con men song tạp giao hệ thống có thể nhanh chóng, trực tiếp phân tích đã biết lòng trắng trứng chi gian hỗ trợ lẫn nhau, cũng có thể tìm kiếm, chia lìa cùng đã biết lòng trắng trứng hỗ trợ lẫn nhau xứng thể, ở nghiên cứu kháng nguyên cùng kháng thể hỗ trợ lẫn nhau, phát hiện tân protein cùng phát hiện protein tân công năng, sàng chọn dược vật tác dụng vị điểm cập dược vật đối lòng trắng trứng lẫn nhau làm ảnh hưởng, thành lập gien tổ lòng trắng trứng xích đồ chờ phương diện ứng dụng rộng khắp.
2, miễn dịch cộng lắng đọng lại
Miễn dịch cộng lắng đọng lại ( Co-Immunoprecipitation, Co-IP ) là một loại lấy kháng thể cùng kháng nguyên chi gian chuyên nhất tính tác dụng làm cơ sở dùng cho nghiên cứu hai cái lòng trắng trứng hỗ trợ lẫn nhau kinh điển phương pháp.
Nguyên lý: Căn cứ vào kháng thể cùng kháng nguyên ( bia lòng trắng trứng ) chi gian đặc dị tính kết hợp, lúc này nếu hàng mẫu dung dịch trung tồn tại có thể cùng bia lòng trắng trứng hỗ trợ lẫn nhau mục đích lòng trắng trứng, sẽ cùng bị kéo xuống tới, theo sau lợi dụng SDS-PAGE, Western Blot chờ phương pháp đối được đến mục tiêu lòng trắng trứng tiến hành phân tích, tiến tới chứng minh hai người gian hỗ trợ lẫn nhau.
Thông tục điểm tới nói, giả thiết chúng ta yêu cầu nghiên cứu hàng mẫu trung A lòng trắng trứng cùng B lòng trắng trứng chi gian hay không tồn tại một ít hỗ trợ lẫn nhau, đầu tiên chúng ta thông qua thích hợp phương pháp xử lý hàng mẫu, đem lòng trắng trứng lấy ra ra tới ( đồng thời không thể phá hư lòng trắng trứng chi gian hỗ trợ lẫn nhau ), sau đó dùng trước kết hợp rau câu đường châu hoặc là từ châu A lòng trắng trứng kháng thể bắt được hàng mẫu trung A lòng trắng trứng, như vậy cùng A lòng trắng trứng kết hợp B lòng trắng trứng cũng có thể cùng nhau lắng đọng lại xuống dưới. Lại đem lòng trắng trứng từ hạt châu thượng phân tách xuống dưới, đối B lòng trắng trứng tiến hành kiểm tra đo lường, có thể kiểm tra đo lường đến, thuyết minh B lòng trắng trứng ở phía trước lắng đọng lại trong quá trình theo A lòng trắng trứng cùng nhau bị kéo xuống tới, tiến tới chứng minh hai người chi gian tồn tại lẫn nhau quan hệ.
( DOI: 10.1007/978-1-4939-7033-9_17 )
3, miễn dịch ánh huỳnh quang cộng định vị
Đem miễn dịch học phương pháp ( kháng nguyên kháng thể đặc dị kết hợp ) cùng ánh huỳnh quang đánh dấu kỹ thuật kết hợp lên nghiên cứu đặc dị lòng trắng trứng kháng nguyên ở tế bào nội phân bố phương pháp. Giống nhau dùng để nghiệm chứng 2 loại hoặc 3 trứng giống bạch hay không tồn tại cộng định vị quan hệ.
Bởi vì ánh huỳnh quang tố phát ra ánh huỳnh quang nhưng ở ánh huỳnh quang kính hiển vi hạ kiểm ra, do đó nhưng đối kháng nguyên tiến hành tế bào định vị. Hai loại bất đồng lòng trắng trứng sử dụng bất đồng thuộc tính bất đồng nhan sắc ánh huỳnh quang đánh dấu sau, thông qua quan sát nhan sắc biến hóa xác định hay không có cộng định vị, cũng có thể sử dụng phần mềm tiến hành phân tích.
Nên kỹ thuật chủ yếu đặc điểm là: Đặc dị tính cường, mẫn cảm tính cao, tốc độ mau. Chủ yếu khuyết điểm là: Không những khác phái nhuộm màu vấn đề chưa hoàn toàn giải quyết, kết quả phán định khách quan tính không đủ, kỹ thuật trình tự cũng còn tương đối phức tạp.
4, Pull-down thực nghiệm
Pull-down thực nghiệm, lại xưng kéo xuống thực nghiệm, là một loại bên ngoài cơ thể thân hòa thuần hóa kỹ thuật. ( cái này thực nghiệm cùng miễn dịch cộng lắng đọng lại thực nghiệm rất giống, bất đồng chính là miễn dịch cộng lắng đọng lại là ở tế bào tiến hành. )
Nguyên lý: Đem một loại protein cố định với nào đó cơ chất thượng ( như Sepharose ), nhưng tế bào trừu đề dịch trải qua nên cơ chất khi, nhưng cùng nên cố định lòng trắng trứng hỗ trợ lẫn nhau xứng thể lòng trắng trứng bị hấp thụ, mà không có bị hấp thụ “Tạp chất” tắc tùy tẩy thoát dịch chảy ra. Bị hấp thụ lòng trắng trứng có thể thông qua thay đổi tẩy thoát dịch hoặc tẩy thoát điều kiện mà thu về xuống dưới.
Vì càng có hiệu mà lợi dụng pull down kỹ thuật, có thể đem đãi thuần hóa lòng trắng trứng lấy dung hợp lòng trắng trứng hình thức biểu đạt, sắp “Mồi” lòng trắng trứng cùng một loại dễ dàng thuần hóa xứng thể lòng trắng trứng tương dung hợp. 1988 năm Smith chờ lợi dụng cốc quang cam thái -S- dời đi môi ( GST ) dung hợp nhãn từ vi khuẩn trung một bước thuần hóa ra GST dung hợp lòng trắng trứng.
GST Pull-Down thực nghiệm: Lợi dụng DNA trọng tổ kỹ thuật đem đã biết lòng trắng trứng cùng GST dung hợp, mà dung hợp lòng trắng trứng thông qua GST cùng cố hóa ở vật dẫn thượng GTH ( cốc quang cam thái ) thân hòa kết hợp. Đơn giản tới nói, chúng ta giả định a lòng trắng trứng cùng b lòng trắng trứng khả năng tồn tại lẫn nhau làm, đem thuần hóa dung hợp GST a lòng trắng trứng cùng thuần hóa b lòng trắng trứng cùng với có thể đặc dị tính kết hợp GST Sephrose 4B beads hỗn hợp ở bên nhau ấp trứng thời gian nhất định, sau đó tẩy đi chưa kết hợp lòng trắng trứng, nấu phí beads tiến hành SDS-PAGE điện vịnh. Thông qua Western blot kiểm tra đo lường kết quả, chúng ta có thể nhìn đến GST-a lòng trắng trứng cùng b lòng trắng trứng sở đối ứng điều mang, tức biểu lộ a lòng trắng trứng cùng b lòng trắng trứng nhân phát sinh hỗ trợ lẫn nhau mà bị GST-a pull down ( GST đối chiếu chỉ biểu hiện một cái điều mang ).
pull down kỹ thuật nhưng dùng cho nghiệm chứng đã biết lòng trắng trứng hoặc thái hỗ trợ lẫn nhau, cũng có thể dùng để sàng chọn cùng đã biết lòng trắng trứng hoặc thái lẫn nhau làm không biết lòng trắng trứng hoặc thái. Nhưng là ở trình độ nhất định thượng không thể chân thật phản ứng tế bào nội protein chi gian hỗ trợ lẫn nhau, bởi vì ở bên ngoài cơ thể hỗ trợ lẫn nhau protein ở bình thường sinh lý điều kiện hạ không nhất định sẽ lẫn nhau kết hợp.
5, thân hòa thuần hóa chất phổ ( AP -MS )
AP-MS ( Affinity Purification coupled MS ), tức thân hòa thuần hóa xâu chuỗi chất phổ phân tích.
Nguyên lý: Căn cứ vào đặc dị tính kháng thể hoặc mặt khác thân hòa thuốc thử cùng bia tiêu lòng trắng trứng thân hòa tác dụng, thông qua miễn dịch cộng lắng đọng lại ( co-Immunoprecipitation ) đem bia tiêu lòng trắng trứng cùng bia tiêu lòng trắng trứng hỗ trợ lẫn nhau lòng trắng trứng từ phức tạp sinh vật hệ thống trung thuần hóa ra tới, tiến tới tiến hành chất phổ kiểm tra đo lường lấy giám định bia tiêu lòng trắng trứng hỗ trợ lẫn nhau lòng trắng trứng.
Kinh điển AP-MS thực nghiệm thông thường bao hàm dưới 4 cái mấu chốt bước đi: 1 ) tế bào hoặc tổ chức phân tách; 2 ) lòng trắng trứng dung dịch cùng ngẫu nhiên liên kháng thể thân hòa hơi châu ấp trứng; 3 ) không những khác phái kết hợp cùng bối cảnh lòng trắng trứng rửa sạch cùng với đặc dị tính lẫn nhau làm lòng trắng trứng tẩy thoát; 4 ) lẫn nhau làm lòng trắng trứng chất phổ kiểm tra đo lường cùng phân tích.
6, song phần tử ánh huỳnh quang bổ sung cho nhau kỹ thuật
Song phần tử ánh huỳnh quang bổ sung cho nhau ( Bimolecular fluorescence complementation, BiFC ), nên kỹ thuật là lợi dụng ánh huỳnh quang lòng trắng trứng đặc điểm tới nghiên cứu lòng trắng trứng hỗ trợ lẫn nhau.
Ánh huỳnh quang lòng trắng trứng nhưng từ riêng vị điểm bị tách ra, sinh ra hai cái phi ánh huỳnh quang hoạt tính đoạn ngắn tức N đoan đoạn ngắn ( N-fragment ) cùng C đoan đoạn ngắn ( C-fragment ) ( VN cập VC ). Đương hai mảnh đoạn phân biệt bị dung hợp đến hỗ trợ lẫn nhau lòng trắng trứng thượng khi, sẽ nhân lòng trắng trứng hỗ trợ lẫn nhau lực mà bị kéo gần, phát sinh bổ sung cho nhau do đó một lần nữa xây dựng thành có hoạt tính ánh huỳnh quang lòng trắng trứng cũng ở kích phát quang hạ sinh ra ánh huỳnh quang. Bởi vậy lợi dụng ánh huỳnh quang kính hiển vi liền có thể trực tiếp thông qua quan sát ánh huỳnh quang có vô tới phán đoán lòng trắng trứng hay không phát sinh hỗ trợ lẫn nhau.
Đây là ở sống tế bào trung quan sát lòng trắng trứng hỗ trợ lẫn nhau thực tốt phương pháp.
Phương pháp này vẫn là tồn tại giả dương tính, tế bào đại lượng biểu đạt phân đoạn màu vàng ánh huỳnh quang lòng trắng trứng ( YFP ) khả năng sẽ không chịu nghiên cứu lòng trắng trứng kết hợp cùng không mà chính mình kết hợp ở bên nhau, cho nên âm tính đối chiếu sử dụng trọng yếu phi thường.
7, NanoBiT lòng trắng trứng bổ sung cho nhau kỹ thuật
Này phương pháp cùng BIFC khác nhau lớn nhất ở chỗ, BIFC tách ra chính là YFP ánh huỳnh quang lòng trắng trứng, NanoBiT tách ra chính là đom đóm ánh huỳnh quang tố môi Luciferase. Ánh huỳnh quang tố môi cần phải có đế vật tồn tại, phát ra chính là tự phát ánh huỳnh quang mà phi kích phát quang. Loại này kỹ thuật chỗ tốt là có thể ở sống tế bào tiến hành quan trắc, có thể tiến hành theo dõi theo thời gian thực, định lượng chờ thực nghiệm.
Nên phương pháp lợi dụng phần tử sinh vật học phương pháp đem NanoBit lòng trắng trứng tách ra thành 17.6kDa LgBit cùng 11 cái axit amin SmBit, phân biệt làm lòng trắng trứng biểu đạt vật dẫn mặt trên hai cái nhãn, đương hai cái lòng trắng trứng có thể phát sinh lẫn nhau làm khi, LgBit cùng SmBit không gian khoảng cách kéo gần, kết cấu bổ sung cho nhau hình thành hoàn chỉnh NanoBit lòng trắng trứng, ở đế vật kiểm tra đo lường hạ có thể phát ra rất mạnh luminescent tín hiệu.
Bởi vì NanoBit lòng trắng trứng phân tử lượng tiểu, quang tín hiệu cường, biểu đạt hiệu suất cao, không những khác phái tự phát quang bối cảnh thấp, hơn nữa nhãn lòng trắng trứng kết hợp là đảo ngược, cho nên phương pháp này so BIFC có rất nhiều ưu thế.
Này thực nghiệm lúc đầu yêu cầu sờ soạng LgBit cùng SmBit xây dựng ở bất đồng N đoan hoặc C quả nhiên tổ hợp.
8, ánh huỳnh quang cộng hưởng năng lượng dời đi
Ánh huỳnh quang cộng hưởng năng lượng dời đi ( Fluorescent Resonance Energy Transfer, FRET) là một loại thông qua ánh huỳnh quang vật chất gian phát sinh phi phóng xạ năng lượng dời đi tiến hành phân tích quang phổ phân tích pháp.
Đương cung thể ánh huỳnh quang phần tử phóng ra quang phổ cùng chịu thể ánh huỳnh quang phần tử quang phổ hấp thu trùng điệp, hơn nữa hai cái phần tử khoảng cách ở 10nm phạm vi trong vòng khi, liền sẽ phát sinh một loại phi tính phóng xạ năng lượng dời đi, tức FRET hiện tượng, khiến cho cung thể ánh huỳnh quang cường độ so nó đơn độc tồn tại khi muốn thấp nhiều ( ánh huỳnh quang thốt diệt ), mà chịu thể phóng ra ánh huỳnh quang lại đại đại tăng cường ( mẫn hóa ánh huỳnh quang ).
Màu xanh lơ ánh huỳnh quang lòng trắng trứng ( cyan fluorescent protein, CFP ), màu vàng ánh huỳnh quang lòng trắng trứng ( yellow fluorescent protein, YFP ) vì trước mắt lòng trắng trứng - lòng trắng trứng hỗ trợ lẫn nhau nghiên cứu trung nhất rộng khắp ứng dụng FRET đối.
Cái này kỹ thuật không chỉ có có thể nghiệm chứng protein hỗ trợ lẫn nhau, còn có thể đủ biểu chinh loại này hỗ trợ lẫn nhau khoảng cách động thái biến hóa, tỷ như protein phần tử trực tiếp tương đối vận động phương hướng tốc độ chờ.
9, sinh vật sáng lên năng lượng cộng hưởng dời đi (BRET)
Dùng sinh vật sáng lên lòng trắng trứng thay thế ánh huỳnh quang cung thể, không ỷ lại với kích phát quang, kiểm tra đo lường bối cảnh thấp.
Ở BRET kỹ thuật trung, lòng trắng trứng A dung hợp ánh huỳnh quang tố môi ( thông thường là hải thận ánh huỳnh quang tố môi ), làm năng lượng cung thể, lòng trắng trứng B dung hợp có chứa ánh huỳnh quang gốc nhãn lòng trắng trứng, làm năng lượng chịu thể, nếu lòng trắng trứng A, B tồn tại hỗ trợ lẫn nhau khi, gia nhập ánh huỳnh quang tố môi đế vật sau, ánh huỳnh quang tố môi sáng lên có thể kích phát tới gần lòng trắng trứng B ánh huỳnh quang gốc sáng lên, thông qua kiểm tra đo lường ánh huỳnh quang cùng sáng lên tín hiệu so giá trị, tới kiểm tra đo lường lòng trắng trứng hỗ trợ lẫn nhau. Nếu lòng trắng trứng A cùng B vô tướng lẫn nhau tác dụng, ánh huỳnh quang tố môi sáng lên năng lượng đem vô pháp truyền lại đến chịu thể lòng trắng trứng, do đó chịu thể lòng trắng trứng sẽ không bị kích phát sinh ra ánh huỳnh quang tín hiệu.
Phương pháp này cùng FRET so sánh với, dùng sinh vật sáng lên lòng trắng trứng thay thế ánh huỳnh quang cung thể, không ỷ lại với kích phát quang, kiểm tra đo lường bối cảnh thấp; không cần tẩy trắng, tế bào hư hao càng thiếu; đồng thời cũng tránh cho tự phát ánh huỳnh quang quấy nhiễu; làm cung thể NanoLuc huỳnh quang tố môi lòng trắng trứng phân tử lượng tiểu, càng thích hợp dung hợp lòng trắng trứng biểu đạt xây dựng, hơn nữa quang tín hiệu cường.
Nhưng là, nó yêu cầu ghép đôi đế vật, hơn nữa cái này đế vật còn không tiện nghi, yêu cầu đại lượng sử dụng nói muốn suy xét hảo kinh tế vấn đề.
10, DUOLINK thực nghiệm
Duolink thực nghiệm căn cứ vào lân vị liên tiếp kỹ thuật (proximity ligation assay, PLA), đương một đôi PLA probes cũng đủ tiếp cận khi ( nhỏ hơn 40 nm) sẽ sinh ra PLA tín hiệu, bởi vì PLA probes đặc dị phân biệt một kháng, PLA tín hiệu mạnh yếu trực tiếp phản ánh lòng trắng trứng biểu đạt lượng trình độ hoặc lòng trắng trứng lẫn nhau làm cường độ.
Lợi dụng ánh huỳnh quang kính hiển vi có thể quan sát đến PLA tín hiệu và vị trí, thông qua DuolinkImageTool có thể tiến hành chính xác định lượng cùng biểu đạt sai biệt chia đều tích. Duolink thực nghiệm có thể đồng thời thực hiện đối lòng trắng trứng - lòng trắng trứng lẫn nhau làm, lòng trắng trứng biểu đạt hoặc lòng trắng trứng phiên dịch sau tân trang tiến hành định vị, định lượng cùng kiểm tra đo lường.
Thông qua Duolink kỹ thuật, nhưng đem lòng trắng trứng tín hiệu phóng đại 1000 lần, mắt thường có thể kiểm tra đo lường lòng trắng trứng và lẫn nhau làm, thả toàn bộ thực nghiệm phương án đơn giản trực tiếp.
Nghiên cứu lòng trắng trứng lẫn nhau làm phương pháp có rất nhiều, hôm nay tiểu biên liền vài loại thường dùng phương pháp làm đơn giản tường thuật tóm lược, hy vọng có thể trợ giúp đến đại gia.
1, con men song tạp giao hệ thống
Nguyên lý: Rất nhiều thật hạch sinh vật vị điểm đặc dị sang băng kích hoạt ước số thông thường có hai cái nhưng phân cách khai kết cấu vực, tức DNA đặc dị kết hợp vực ( DNA-binding domain, BD ) cùng sang băng kích hoạt vực ( Transcriptional activationdomain, AD ). Này hai cái kết cấu vực các cụ công năng, lẫn nhau không ảnh hưởng, nhưng một cái hoàn chỉnh kích hoạt riêng gien biểu đạt kích hoạt ước số cần thiết đồng thời đựng này hai cái kết cấu vực, nếu không vô pháp hoàn thành kích hoạt công năng.
Đem hai đãi trắc nghiên cứu lòng trắng trứng ( lòng trắng trứng X cùng lòng trắng trứng Y ) phân biệt cùng BD, AD kết cấu vực xây dựng dung hợp chất viên. Đem xây dựng tốt hai cái chất viên chuyển nhập cùng con men tế bào trung biểu đạt, nếu hai lòng trắng trứng chi gian không tồn tại hỗ trợ lẫn nhau, tắc hạ du gien ( báo cáo gien ) sẽ không sang băng biểu đạt; nếu hai cái lòng trắng trứng tồn tại hỗ trợ lẫn nhau, tắc BD cùng AD hai kết cấu vực không gian thượng thực tiếp cận, do đó hạ du gien ( báo cáo gien ) được đến sang băng. Phán đoán thông qua báo cáo gien biểu đạt cùng không, có thể phán đoán hai lòng trắng trứng chi gian hay không tồn tại hỗ trợ lẫn nhau.
Dùng con men song tạp giao hệ thống có thể nhanh chóng, trực tiếp phân tích đã biết lòng trắng trứng chi gian hỗ trợ lẫn nhau, cũng có thể tìm kiếm, chia lìa cùng đã biết lòng trắng trứng hỗ trợ lẫn nhau xứng thể, ở nghiên cứu kháng nguyên cùng kháng thể hỗ trợ lẫn nhau, phát hiện tân protein cùng phát hiện protein tân công năng, sàng chọn dược vật tác dụng vị điểm cập dược vật đối lòng trắng trứng lẫn nhau làm ảnh hưởng, thành lập gien tổ lòng trắng trứng xích đồ chờ phương diện ứng dụng rộng khắp.
2, miễn dịch cộng lắng đọng lại
Miễn dịch cộng lắng đọng lại ( Co-Immunoprecipitation, Co-IP ) là một loại lấy kháng thể cùng kháng nguyên chi gian chuyên nhất tính tác dụng làm cơ sở dùng cho nghiên cứu hai cái lòng trắng trứng hỗ trợ lẫn nhau kinh điển phương pháp.
Nguyên lý: Căn cứ vào kháng thể cùng kháng nguyên ( bia lòng trắng trứng ) chi gian đặc dị tính kết hợp, lúc này nếu hàng mẫu dung dịch trung tồn tại có thể cùng bia lòng trắng trứng hỗ trợ lẫn nhau mục đích lòng trắng trứng, sẽ cùng bị kéo xuống tới, theo sau lợi dụng SDS-PAGE, Western Blot chờ phương pháp đối được đến mục tiêu lòng trắng trứng tiến hành phân tích, tiến tới chứng minh hai người gian hỗ trợ lẫn nhau.
Thông tục điểm tới nói, giả thiết chúng ta yêu cầu nghiên cứu hàng mẫu trung A lòng trắng trứng cùng B lòng trắng trứng chi gian hay không tồn tại một ít hỗ trợ lẫn nhau, đầu tiên chúng ta thông qua thích hợp phương pháp xử lý hàng mẫu, đem lòng trắng trứng lấy ra ra tới ( đồng thời không thể phá hư lòng trắng trứng chi gian hỗ trợ lẫn nhau ), sau đó dùng trước kết hợp rau câu đường châu hoặc là từ châu A lòng trắng trứng kháng thể bắt được hàng mẫu trung A lòng trắng trứng, như vậy cùng A lòng trắng trứng kết hợp B lòng trắng trứng cũng có thể cùng nhau lắng đọng lại xuống dưới. Lại đem lòng trắng trứng từ hạt châu thượng phân tách xuống dưới, đối B lòng trắng trứng tiến hành kiểm tra đo lường, có thể kiểm tra đo lường đến, thuyết minh B lòng trắng trứng ở phía trước lắng đọng lại trong quá trình theo A lòng trắng trứng cùng nhau bị kéo xuống tới, tiến tới chứng minh hai người chi gian tồn tại lẫn nhau quan hệ.
( DOI: 10.1007/978-1-4939-7033-9_17 )
3, miễn dịch ánh huỳnh quang cộng định vị
Đem miễn dịch học phương pháp ( kháng nguyên kháng thể đặc dị kết hợp ) cùng ánh huỳnh quang đánh dấu kỹ thuật kết hợp lên nghiên cứu đặc dị lòng trắng trứng kháng nguyên ở tế bào nội phân bố phương pháp. Giống nhau dùng để nghiệm chứng 2 loại hoặc 3 trứng giống bạch hay không tồn tại cộng định vị quan hệ.
Bởi vì ánh huỳnh quang tố phát ra ánh huỳnh quang nhưng ở ánh huỳnh quang kính hiển vi hạ kiểm ra, do đó nhưng đối kháng nguyên tiến hành tế bào định vị. Hai loại bất đồng lòng trắng trứng sử dụng bất đồng thuộc tính bất đồng nhan sắc ánh huỳnh quang đánh dấu sau, thông qua quan sát nhan sắc biến hóa xác định hay không có cộng định vị, cũng có thể sử dụng phần mềm tiến hành phân tích.
Nên kỹ thuật chủ yếu đặc điểm là: Đặc dị tính cường, mẫn cảm tính cao, tốc độ mau. Chủ yếu khuyết điểm là: Không những khác phái nhuộm màu vấn đề chưa hoàn toàn giải quyết, kết quả phán định khách quan tính không đủ, kỹ thuật trình tự cũng còn tương đối phức tạp.
4, Pull-down thực nghiệm
Pull-down thực nghiệm, lại xưng kéo xuống thực nghiệm, là một loại bên ngoài cơ thể thân hòa thuần hóa kỹ thuật. ( cái này thực nghiệm cùng miễn dịch cộng lắng đọng lại thực nghiệm rất giống, bất đồng chính là miễn dịch cộng lắng đọng lại là ở tế bào tiến hành. )
Nguyên lý: Đem một loại protein cố định với nào đó cơ chất thượng ( như Sepharose ), nhưng tế bào trừu đề dịch trải qua nên cơ chất khi, nhưng cùng nên cố định lòng trắng trứng hỗ trợ lẫn nhau xứng thể lòng trắng trứng bị hấp thụ, mà không có bị hấp thụ “Tạp chất” tắc tùy tẩy thoát dịch chảy ra. Bị hấp thụ lòng trắng trứng có thể thông qua thay đổi tẩy thoát dịch hoặc tẩy thoát điều kiện mà thu về xuống dưới.
Vì càng có hiệu mà lợi dụng pull down kỹ thuật, có thể đem đãi thuần hóa lòng trắng trứng lấy dung hợp lòng trắng trứng hình thức biểu đạt, sắp “Mồi” lòng trắng trứng cùng một loại dễ dàng thuần hóa xứng thể lòng trắng trứng tương dung hợp. 1988 năm Smith chờ lợi dụng cốc quang cam thái -S- dời đi môi ( GST ) dung hợp nhãn từ vi khuẩn trung một bước thuần hóa ra GST dung hợp lòng trắng trứng.
GST Pull-Down thực nghiệm: Lợi dụng DNA trọng tổ kỹ thuật đem đã biết lòng trắng trứng cùng GST dung hợp, mà dung hợp lòng trắng trứng thông qua GST cùng cố hóa ở vật dẫn thượng GTH ( cốc quang cam thái ) thân hòa kết hợp. Đơn giản tới nói, chúng ta giả định a lòng trắng trứng cùng b lòng trắng trứng khả năng tồn tại lẫn nhau làm, đem thuần hóa dung hợp GST a lòng trắng trứng cùng thuần hóa b lòng trắng trứng cùng với có thể đặc dị tính kết hợp GST Sephrose 4B beads hỗn hợp ở bên nhau ấp trứng thời gian nhất định, sau đó tẩy đi chưa kết hợp lòng trắng trứng, nấu phí beads tiến hành SDS-PAGE điện vịnh. Thông qua Western blot kiểm tra đo lường kết quả, chúng ta có thể nhìn đến GST-a lòng trắng trứng cùng b lòng trắng trứng sở đối ứng điều mang, tức biểu lộ a lòng trắng trứng cùng b lòng trắng trứng nhân phát sinh hỗ trợ lẫn nhau mà bị GST-a pull down ( GST đối chiếu chỉ biểu hiện một cái điều mang ).
pull down kỹ thuật nhưng dùng cho nghiệm chứng đã biết lòng trắng trứng hoặc thái hỗ trợ lẫn nhau, cũng có thể dùng để sàng chọn cùng đã biết lòng trắng trứng hoặc thái lẫn nhau làm không biết lòng trắng trứng hoặc thái. Nhưng là ở trình độ nhất định thượng không thể chân thật phản ứng tế bào nội protein chi gian hỗ trợ lẫn nhau, bởi vì ở bên ngoài cơ thể hỗ trợ lẫn nhau protein ở bình thường sinh lý điều kiện hạ không nhất định sẽ lẫn nhau kết hợp.
5, thân hòa thuần hóa chất phổ ( AP -MS )
AP-MS ( Affinity Purification coupled MS ), tức thân hòa thuần hóa xâu chuỗi chất phổ phân tích.
Nguyên lý: Căn cứ vào đặc dị tính kháng thể hoặc mặt khác thân hòa thuốc thử cùng bia tiêu lòng trắng trứng thân hòa tác dụng, thông qua miễn dịch cộng lắng đọng lại ( co-Immunoprecipitation ) đem bia tiêu lòng trắng trứng cùng bia tiêu lòng trắng trứng hỗ trợ lẫn nhau lòng trắng trứng từ phức tạp sinh vật hệ thống trung thuần hóa ra tới, tiến tới tiến hành chất phổ kiểm tra đo lường lấy giám định bia tiêu lòng trắng trứng hỗ trợ lẫn nhau lòng trắng trứng.
Kinh điển AP-MS thực nghiệm thông thường bao hàm dưới 4 cái mấu chốt bước đi: 1 ) tế bào hoặc tổ chức phân tách; 2 ) lòng trắng trứng dung dịch cùng ngẫu nhiên liên kháng thể thân hòa hơi châu ấp trứng; 3 ) không những khác phái kết hợp cùng bối cảnh lòng trắng trứng rửa sạch cùng với đặc dị tính lẫn nhau làm lòng trắng trứng tẩy thoát; 4 ) lẫn nhau làm lòng trắng trứng chất phổ kiểm tra đo lường cùng phân tích.
6, song phần tử ánh huỳnh quang bổ sung cho nhau kỹ thuật
Song phần tử ánh huỳnh quang bổ sung cho nhau ( Bimolecular fluorescence complementation, BiFC ), nên kỹ thuật là lợi dụng ánh huỳnh quang lòng trắng trứng đặc điểm tới nghiên cứu lòng trắng trứng hỗ trợ lẫn nhau.
Ánh huỳnh quang lòng trắng trứng nhưng từ riêng vị điểm bị tách ra, sinh ra hai cái phi ánh huỳnh quang hoạt tính đoạn ngắn tức N đoan đoạn ngắn ( N-fragment ) cùng C đoan đoạn ngắn ( C-fragment ) ( VN cập VC ). Đương hai mảnh đoạn phân biệt bị dung hợp đến hỗ trợ lẫn nhau lòng trắng trứng thượng khi, sẽ nhân lòng trắng trứng hỗ trợ lẫn nhau lực mà bị kéo gần, phát sinh bổ sung cho nhau do đó một lần nữa xây dựng thành có hoạt tính ánh huỳnh quang lòng trắng trứng cũng ở kích phát quang hạ sinh ra ánh huỳnh quang. Bởi vậy lợi dụng ánh huỳnh quang kính hiển vi liền có thể trực tiếp thông qua quan sát ánh huỳnh quang có vô tới phán đoán lòng trắng trứng hay không phát sinh hỗ trợ lẫn nhau.
Đây là ở sống tế bào trung quan sát lòng trắng trứng hỗ trợ lẫn nhau thực tốt phương pháp.
Phương pháp này vẫn là tồn tại giả dương tính, tế bào đại lượng biểu đạt phân đoạn màu vàng ánh huỳnh quang lòng trắng trứng ( YFP ) khả năng sẽ không chịu nghiên cứu lòng trắng trứng kết hợp cùng không mà chính mình kết hợp ở bên nhau, cho nên âm tính đối chiếu sử dụng trọng yếu phi thường.
7, NanoBiT lòng trắng trứng bổ sung cho nhau kỹ thuật
Này phương pháp cùng BIFC khác nhau lớn nhất ở chỗ, BIFC tách ra chính là YFP ánh huỳnh quang lòng trắng trứng, NanoBiT tách ra chính là đom đóm ánh huỳnh quang tố môi Luciferase. Ánh huỳnh quang tố môi cần phải có đế vật tồn tại, phát ra chính là tự phát ánh huỳnh quang mà phi kích phát quang. Loại này kỹ thuật chỗ tốt là có thể ở sống tế bào tiến hành quan trắc, có thể tiến hành theo dõi theo thời gian thực, định lượng chờ thực nghiệm.
Nên phương pháp lợi dụng phần tử sinh vật học phương pháp đem NanoBit lòng trắng trứng tách ra thành 17.6kDa LgBit cùng 11 cái axit amin SmBit, phân biệt làm lòng trắng trứng biểu đạt vật dẫn mặt trên hai cái nhãn, đương hai cái lòng trắng trứng có thể phát sinh lẫn nhau làm khi, LgBit cùng SmBit không gian khoảng cách kéo gần, kết cấu bổ sung cho nhau hình thành hoàn chỉnh NanoBit lòng trắng trứng, ở đế vật kiểm tra đo lường hạ có thể phát ra rất mạnh luminescent tín hiệu.
Bởi vì NanoBit lòng trắng trứng phân tử lượng tiểu, quang tín hiệu cường, biểu đạt hiệu suất cao, không những khác phái tự phát quang bối cảnh thấp, hơn nữa nhãn lòng trắng trứng kết hợp là đảo ngược, cho nên phương pháp này so BIFC có rất nhiều ưu thế.
Này thực nghiệm lúc đầu yêu cầu sờ soạng LgBit cùng SmBit xây dựng ở bất đồng N đoan hoặc C quả nhiên tổ hợp.
8, ánh huỳnh quang cộng hưởng năng lượng dời đi
Ánh huỳnh quang cộng hưởng năng lượng dời đi ( Fluorescent Resonance Energy Transfer, FRET) là một loại thông qua ánh huỳnh quang vật chất gian phát sinh phi phóng xạ năng lượng dời đi tiến hành phân tích quang phổ phân tích pháp.
Đương cung thể ánh huỳnh quang phần tử phóng ra quang phổ cùng chịu thể ánh huỳnh quang phần tử quang phổ hấp thu trùng điệp, hơn nữa hai cái phần tử khoảng cách ở 10nm phạm vi trong vòng khi, liền sẽ phát sinh một loại phi tính phóng xạ năng lượng dời đi, tức FRET hiện tượng, khiến cho cung thể ánh huỳnh quang cường độ so nó đơn độc tồn tại khi muốn thấp nhiều ( ánh huỳnh quang thốt diệt ), mà chịu thể phóng ra ánh huỳnh quang lại đại đại tăng cường ( mẫn hóa ánh huỳnh quang ).
Màu xanh lơ ánh huỳnh quang lòng trắng trứng ( cyan fluorescent protein, CFP ), màu vàng ánh huỳnh quang lòng trắng trứng ( yellow fluorescent protein, YFP ) vì trước mắt lòng trắng trứng - lòng trắng trứng hỗ trợ lẫn nhau nghiên cứu trung nhất rộng khắp ứng dụng FRET đối.
Cái này kỹ thuật không chỉ có có thể nghiệm chứng protein hỗ trợ lẫn nhau, còn có thể đủ biểu chinh loại này hỗ trợ lẫn nhau khoảng cách động thái biến hóa, tỷ như protein phần tử trực tiếp tương đối vận động phương hướng tốc độ chờ.
9, sinh vật sáng lên năng lượng cộng hưởng dời đi (BRET)
Dùng sinh vật sáng lên lòng trắng trứng thay thế ánh huỳnh quang cung thể, không ỷ lại với kích phát quang, kiểm tra đo lường bối cảnh thấp.
Ở BRET kỹ thuật trung, lòng trắng trứng A dung hợp ánh huỳnh quang tố môi ( thông thường là hải thận ánh huỳnh quang tố môi ), làm năng lượng cung thể, lòng trắng trứng B dung hợp có chứa ánh huỳnh quang gốc nhãn lòng trắng trứng, làm năng lượng chịu thể, nếu lòng trắng trứng A, B tồn tại hỗ trợ lẫn nhau khi, gia nhập ánh huỳnh quang tố môi đế vật sau, ánh huỳnh quang tố môi sáng lên có thể kích phát tới gần lòng trắng trứng B ánh huỳnh quang gốc sáng lên, thông qua kiểm tra đo lường ánh huỳnh quang cùng sáng lên tín hiệu so giá trị, tới kiểm tra đo lường lòng trắng trứng hỗ trợ lẫn nhau. Nếu lòng trắng trứng A cùng B vô tướng lẫn nhau tác dụng, ánh huỳnh quang tố môi sáng lên năng lượng đem vô pháp truyền lại đến chịu thể lòng trắng trứng, do đó chịu thể lòng trắng trứng sẽ không bị kích phát sinh ra ánh huỳnh quang tín hiệu.
Phương pháp này cùng FRET so sánh với, dùng sinh vật sáng lên lòng trắng trứng thay thế ánh huỳnh quang cung thể, không ỷ lại với kích phát quang, kiểm tra đo lường bối cảnh thấp; không cần tẩy trắng, tế bào hư hao càng thiếu; đồng thời cũng tránh cho tự phát ánh huỳnh quang quấy nhiễu; làm cung thể NanoLuc huỳnh quang tố môi lòng trắng trứng phân tử lượng tiểu, càng thích hợp dung hợp lòng trắng trứng biểu đạt xây dựng, hơn nữa quang tín hiệu cường.
Nhưng là, nó yêu cầu ghép đôi đế vật, hơn nữa cái này đế vật còn không tiện nghi, yêu cầu đại lượng sử dụng nói muốn suy xét hảo kinh tế vấn đề.
10, DUOLINK thực nghiệm
Duolink thực nghiệm căn cứ vào lân vị liên tiếp kỹ thuật (proximity ligation assay, PLA), đương một đôi PLA probes cũng đủ tiếp cận khi ( nhỏ hơn 40 nm) sẽ sinh ra PLA tín hiệu, bởi vì PLA probes đặc dị phân biệt một kháng, PLA tín hiệu mạnh yếu trực tiếp phản ánh lòng trắng trứng biểu đạt lượng trình độ hoặc lòng trắng trứng lẫn nhau làm cường độ.
Lợi dụng ánh huỳnh quang kính hiển vi có thể quan sát đến PLA tín hiệu và vị trí, thông qua DuolinkImageTool có thể tiến hành chính xác định lượng cùng biểu đạt sai biệt chia đều tích. Duolink thực nghiệm có thể đồng thời thực hiện đối lòng trắng trứng - lòng trắng trứng lẫn nhau làm, lòng trắng trứng biểu đạt hoặc lòng trắng trứng phiên dịch sau tân trang tiến hành định vị, định lượng cùng kiểm tra đo lường.
Thông qua Duolink kỹ thuật, nhưng đem lòng trắng trứng tín hiệu phóng đại 1000 lần, mắt thường có thể kiểm tra đo lường lòng trắng trứng và lẫn nhau làm, thả toàn bộ thực nghiệm phương án đơn giản trực tiếp.