【 tuyến đầu tiến triển 】 chuyên gia lời bình Nat Methods 丨 Trần Linh linh tổ lợi dụng CRISPR-dCas12 hệ thống thực hiện phi lặp lại cơ…

Lời bình | trần khuông khi ( Bắc Kinh đại học ), mã hàm tuệ ( Thượng Hải khoa học kỹ thuật đại học )

Sống tế bào truy tung DNA, RNA chờ acid nucleic không gian phân bố cùng động thái biến hóa đối với hiểu biết gien biểu đạt điều tiết khống chế cơ chế có thập phần quan trọng ý nghĩa. Nơi phát ra với vi khuẩn cùng cổ vi khuẩn trong cơ thể miễn dịch nhận được hệ thống CRISPR-Cas hệ thống bởi vì này đặc dị tính bia hướng DNA/RNA năng lực, đã bị rộng khắp khai phá thành nhiều loại tế bào nội DNA/RNA di truyền thao tác cùng kiểm tra đo lường đánh dấu công cụ.

Trung Quốc viện khoa học phần tử tế bào khoa học trác tuyệt sáng tạo trung tâm ( sinh vật hóa học cùng tế bào sinh vật học viện nghiên cứu ) Trần Linh linh nghiên cứu tổ giai đoạn trước xây dựng căn cứ vào CRISPR-dCas13 RNA đánh dấu hệ thống, cũng thực hiện sống tế bào cùng ngựa vằn cá phôi thai nội RNA thành tượng truy tung cùng với sống tế bào RNA nhiều sắc thành tượng (Yang et al., Mol Cell, 2019; Huang et al., Genome Bio, 2023; Yang et al., Cell Insight, 2022). Mà bia hướng DNA CRISPR-Cas9 hệ thống kinh cải tạo sau nhưng dùng cho sống tế bào DNA thành tượng đánh dấu (Chen et al., Cell, 2013; Ma et al., Nat Biotechnol, 2016). Này đó CRISPR hệ thống ở đánh dấu nội nguyên acid nucleic danh sách phương diện biểu hiện ra này độc đáo ưu thế, nhưng mà đối với phi lặp lại DNA/RNA danh sách sống tế bào đặc dị tính thành tượng trước mắt còn tồn tại rất nhiều hạn chế.

2024 năm 7 nguyệt 4 ngày, Trần Linh linh nghiên cứu tổ ở Nature Methods thượng phát biểu văn chương CRISPR array-mediated imaging of non-repetitive and multiplex genomic loci in living cells. Nên nghiên cứu đối hiện có CRISPR-dCas12a hệ thống tiến hành sàng chọn ưu hoá, xây dựng nhưng dùng cho phi lặp lại danh sách DNA sống tế bào thành tượng CRISPRdelight hệ thống; tiến thêm một bước sử dụng CRISPRdelight hệ thống, công bố gien vị điểm ở nhân tế bào nội định vị cùng với vận động năng lực cùng sang băng hoạt tính tương quan tính; đồng thời lợi dụng RNA thích xứng thể tu sức CRISPR xâu chuỗi danh sách thực hiện đối 4 loại vệ tinh DNA sống tế bào nhiều sắc thành tượng.

CRISPR-Cas12a hệ thống thuộc về loại hình V CRISPR-Cas gia tộc, ở bia hướng DNA đồng thời còn cụ bị đem CRISPR xâu chuỗi danh sách gia công thành hơn thành thục crRNA năng lực ( Zetsche, B. et al., Cell, 2015 ). Bởi vậy CRISPR-Cas12a hệ thống lý luận thượng có thể thông qua CRISPR xâu chuỗi danh sách ở cùng tế bào nội biểu đạt cũng đủ số lượng crRNA do đó thực hiện phi lặp lại danh sách DNA đánh dấu.

Vì nghiệm chứng này một phỏng đoán, nghiên cứu nhân viên lựa chọn sử dụng đã báo đạo có thể lộ rõ đề cao gien biên tập hiệu suất ba loại dLbCas12a đột biến thể, cũng đối chúng nó đánh dấu hơi vệ tinh DNA Sat I cùng Sat III năng lực tiến hành rồi tương đối, phát hiện hyperdLbCas12a đột biến thể ( D156R, D235R, D292R, D350R ) có thể thực hiện càng cao đánh dấu hiệu suất cùng tín hiệu chất lượng. Nghiên cứu nhân viên tiến thêm một bước phát hiện hyperdLbCas12a có thể gia công CRISPR xâu chuỗi danh sách cũng duy trì cùng trực tiếp biểu đạt thành thục crRNA xấp xỉ DNA đánh dấu năng lực, đồng thời sàng chọn ra có thể biểu đạt dài đến 50 thứ crRNA lặp lại danh sách CAG khởi động tử, cũng căn cứ vào này thành lập dùng cho sống tế bào DNA thành tượng CRISPRdelight hệ thống.

Nghiên cứu nhân viên nhằm vào CCAT1 sang băng lúc đầu vị điểm thượng du 10kb khu vực thiết kế 48 điều gRNA, sử dụng CRISPRdelight hệ thống thành công thực hiện CCAT1 gien vị điểm sống tế bào đánh dấu. Lấy đồng dạng phương thức, CRISPRdelight hệ thống ở mặt khác 6 cái phi lặp lại danh sách gien vị điểm đều được đến hữu hiệu nghiệm chứng, hơn nữa nên hệ thống ở HCT116, U2OS cùng với tiểu chuột phôi thai tế bào gốc ( R1 ) trung đồng dạng hữu hiệu. CRISPRdelight hệ thống tương so với phía trước đưa tin căn cứ vào CRISPR-dCas9 CARGO sống tế bào đánh dấu hệ thống ( Gu, B. et al., Science, 2018 ), có chất viên xây dựng phí tổn thấp, chu kỳ đoản, nhưng biểu đạt gRNA số lượng nhiều, đánh dấu hệ thống tạo thành càng ngắn gọn chờ nhiều phương diện ưu điểm.

Nghiên cứu nhân viên lợi dụng CRISPRdelight hệ thống tiến thêm một bước phân tích CCAT1 ở nhân tế bào nội phân bố đặc điểm cùng vận động đặc thù, phát hiện ở vào nhân tế bào màng chỗ Lamin lòng trắng trứng tầng CCAT1 vị điểm vận động năng lực rõ ràng nhược với ở vào nhân tế bào nội CCAT1 vị điểm, tiến thêm một bước kiểm tra đo lường CCAT1 ở trong chứa tử biểu đạt tín hiệu phát hiện Lamin lòng trắng trứng tầng CCAT1 vị điểm sang băng hoạt tính cũng càng nhược. Đồng thời nghiên cứu nhân viên đối HSPH1, HSPA1A chờ nhiệt cơn sốc gien tiến hành rồi đánh dấu, ở hướng tế bào gây 42°C hoặc á thân toan Natri kích thích sau, phát hiện định vị với hạch đốm HSPH1 gien vị điểm sẽ rõ hiện tăng nhiều, hơn nữa ở vào hạch đốm gien vị điểm sang băng hoạt tính cũng rõ ràng càng cường. Này đó kết quả biểu lộ gien tổ DNA nhân tế bào nội không gian vị trí cùng với vận động năng lực cùng biểu đạt hoạt tính tương quan tính.

Cuối cùng, nghiên cứu nhân viên thông qua RNA kết cấu ưu hoá, thành công đem BoxB, Pepper, PP7 cùng MS2 chờ RNA thích giao tử thiết bị cắm vào đến gRNA trung, lợi dụng CRISPRdelight hệ thống cùng này đó thiết bị đối ứng dung hợp ánh huỳnh quang lòng trắng trứng, thực hiện hơi vệ tinh DNA Sat I, Sat II, Sat III cùng Sat α sống tế bào bốn màu đánh dấu ( đồ 1 ). CRISPRdelight hệ thống vì nghiên cứu sống tế bào trung DNA vị điểm không gian vị trí cùng động lực học đặc thù, cung cấp càng đơn giản cùng tiện lợi tân thủ đoạn.

Đồ 1. Sử dụng CRISPRdelight đồng thời đánh dấu nhiều gien tổ DNA vị điểm

Nên nghiên cứu công tác chủ yếu từ phần tử tế bào trác tuyệt trung tâm Trần Linh linh tổ dương lương trung tiến sĩ ( đã tốt nghiệp ), mẫn dật huy thạc sĩ, Lưu dục hân tiến sĩ sinh cộng đồng hoàn thành, Trần Linh linh nghiên cứu viên vì nên luận văn thông tin tác giả. Nên hạng công tác được đến Howard hưu tư y học viện nghiên cứu Zhe (James) Liu giáo thụ, Phục Đán đại học sinh vật y học viện nghiên cứu / Phục Đán đại học phụ thuộc nhi khoa bệnh viện dương lực nghiên cứu viên, đại học Thanh Hoa vương Hải Phong tiến sĩ mạnh mẽ duy trì.

Graphical Abstract

Chuyên gia lời bình

Trần khuông khi ( Bắc Kinh đại học, nghiên cứu viên )

CRISPR/dCas9 thành tượng hệ thống phát triển khiến cho đối tùy ý nhuộm màu chất vị điểm tiến hành thành tượng trở thành khả năng. Nên hệ thống lợi dụng mất đi cắt hoạt tính Cas9 lòng trắng trứng đột biến thể ( dCas9 ), thông qua đối dCas9 tiến hành ánh huỳnh quang đánh dấu, hoặc là cải tạo single guide RNA (sgRNA) ( như cắm vào MS2, pepper chờ thích xứng thể ) làm này có thể bị ánh huỳnh quang đánh dấu, do đó thực hiện đối mục tiêu nhuộm màu chất vị điểm thành tượng. Cứ việc CRISPR/dCas9 hệ thống là trước mắt nhất rộng khắp ứng dụng với sống tế bào gien tạo thành giống hệ thống, nhưng này ở nhiều trọng kiểm tra đo lường ( multiple xing, tức lợi dụng bia hướng bất đồng danh sách nhiều sgRNA đánh dấu cùng cái gien vị điểm hoặc nhiều gien vị điểm ) phương diện tồn tại nhất định cực hạn tính. Cụ thể tới nói, lợi dụng CRISPR/dCas9 tiến hành nhiều trọng kiểm tra đo lường thông thường yêu cầu xây dựng nhiều có chứa bất đồng sgRNA chất viên hoặc chậm virus tới thực hiện nhiều loại sgRNA ở cùng cái tế bào trung đồng thời sang băng. Nhưng mà, loại này phương pháp khả năng dẫn tới bất đồng tế bào trung sgRNA số lượng cùng chủng loại thân thể sai biệt, do đó ảnh hưởng đối mục tiêu gien tổ ở nhiều tế bào trung hiệu suất cao kiểm tra đo lường. Tiến thêm một bước nghiên cứu biểu hiện, thông qua chỉ một chất viên sang băng nhiều sgRNA phương pháp, như CARGO hệ thống, có thể khắc phục một vấn đề này. Nhưng mà, loại này phương pháp yêu cầu đem nhiều sgRNA biểu đạt thiết bị ( như U6-sgRNA sang băng đơn nguyên ) dẫn vào cùng cái chất viên trung, hợp thành bước đi phức tạp thả hiệu suất thấp. Ngoài ra, nhiều khởi động tử đồng thời tồn tại còn khả năng khiến cho mỗi cái sgRNA sang băng lẫn nhau cạnh tranh, dẫn tới nhiều bia hướng sgRNA vô pháp đồng thời tồn tại, tiến tới ảnh hưởng mục tiêu gien vị điểm hiệu suất cao đánh dấu.

Vì phát triển càng áp dụng với nhiều trọng kiểm tra đo lường sống tế bào gien tạo thành giống công cụ, Trần Linh linh đầu đề tổ căn cứ vào nơi phát ra với CRISPR hệ thống V hình CRISPR-Cas12a (Cpf1) hệ thống, phát triển một loại tên là CRISPRdelight kiểu mới đánh dấu kỹ thuật. Cùng CRISPR-Cas9 bất đồng, CRISPR-Cas12a cụ bị gia công tự thân CRISPR RNA (crRNA) năng lực, mà này một năng lực ở đi trừ CRISPR-Cas12a DNA cắt hoạt tính sau vẫn cứ có thể giữ lại. Đầu đề tổ lấy hyperdLbCas12a này biến đổi thể làm CRISPR-delight hiệu ứng lòng trắng trứng, cũng xây dựng có chứa nhiều có thể cùng hyperdLbCas12a kết hợp crRNA chỉ một hàng ngũ RNA, chứng thực ánh huỳnh quang đánh dấu hyperdLbCas12a ở đơn gien vị điểm kiểm tra đo lường độ nhạy cùng đánh dấu hiệu suất phương diện, tương so với căn cứ vào CRISPR-dCas9 CARGO thành tượng hệ thống càng cụ ưu thế. Ngoài ra, trừ bỏ đối hyperdLbCas12a tiến hành ánh huỳnh quang đánh dấu, đầu đề tổ còn chứng thực có thể thông qua cải tạo crRNA, làm này đựng bất đồng chủng loại thích xứng thể ( bao gồm MS2, PP7, Pepper cùng BoxB ) do đó thực hiện bốn màu thành tượng.

Tổng thể tới nói, CRISPRdelight kỹ thuật không chỉ có cụ bị rất cao mở rộng tính, ở nhiều trọng kiểm tra đo lường phương diện cũng so căn cứ vào CRISPR/dCas9 hệ thống càng có ưu thế. Thông qua tiến thêm một bước ưu hoá CRISPRdelight kỹ thuật trung ánh huỳnh quang đoàn lựa chọn, crRNA kết cấu cùng với Cas12a bắn không trúng bia hiệu ứng chờ phương diện, có hi vọng làm này trở thành thúc đẩy 3d gien tổ học, tế bào sinh vật học chờ nghiên cứu lĩnh vực phát triển quan trọng công cụ.

Chuyên gia lời bình

Mã hàm tuệ ( Thượng Hải khoa học kỹ thuật đại học, nghiên cứu viên )

Nhân loại gien tổ trung đựng 2 vạn nhiều mã hóa gien cùng với đại lượng phi mã hóa gien cùng điều tiết khống chế thiết bị. Gien tổ DNA 3d kết cấu cùng động thái biến hóa ở gien sang băng điều tiết khống chế, tế bào phân hoá, thân thể phát dục cùng với bệnh tật phát sinh trong quá trình quan trọng nhất. Dùng cho nghiên cứu gien tổ DNA 3d kết cấu phương pháp đông đảo, tỷ như căn cứ vào cao thông lượng DNA trắc tự Hi-C, căn cứ vào siêu độ phân giải kính hiển vi MERFISH chờ, trước mắt đã tích lũy đại lượng số liệu dùng cho phân tích cùng thăm dò gien tổ DNA 3d kết cấu cùng công năng quan hệ. Nhưng gien tổ DNA ở sống tế bào trung động thái biến hóa và công năng nghiên cứu nghiêm trọng lạc hậu, nguyên nhân chủ yếu là khuyết thiếu một cái hiệu suất cao, thật khi thành tượng phi lặp lại danh sách DNA ( bao gồm gien hoặc gien điều tiết khống chế thiết bị ) công cụ. Nước Mỹ quốc lập vệ sinh viện nghiên cứu giúp đỡ 4D hạch thể kế hoạch II kỳ ( 4D Nucleome Program ) đem gien tổ thật khi động thái biến hóa cùng công năng làm yêu cầu đột phá trọng điểm nội dung chi nhất.

Căn cứ vào CRISPR sống tế bào DNA thành tượng kỹ thuật có thể hữu hiệu mà kỳ tung gien tổ trung lặp lại danh sách động thái biến hóa, nhưng là thật khi thành tượng phi lặp lại danh sách DNA vẫn phi thường khó khăn, chủ yếu bình cảnh ở chỗ này tin táo so ( Signal-to-Noise Ratio ) thấp, á tế bào định vị cùng thời gian dài kỳ tung đều phi thường có tính khiêu chiến. Bởi vậy này một lĩnh vực nghiên cứu nhân viên vẫn luôn tận sức với như thế nào đề cao tín hiệu cùng hạ thấp tạp âm, chờ mong thực hiện hiệu suất cao, thật khi thành tượng gien tổ DNA và ở gien điều tiết khống chế trong quá trình động thái biến hóa. Trung Quốc viện khoa học phần tử tế bào khoa học trác tuyệt trung tâm Trần Linh linh đầu đề tổ cùng này hợp tác giả sắp tới khai phá CRISPRdelight, xảo diệu mà giải quyết này một nan đề.

Đề cao tín hiệu phương pháp chủ yếu thông qua gia tăng riêng khu vực nội bia hướng vị điểm số lượng ( tiling array of gRNAs ) tỷ như CARGO hệ thống, hoặc đối đơn cái bia hướng vị điểm tín hiệu phóng đại tỷ như Casilio hoặc CRISPR FISHer. Này đó hệ thống đều là căn cứ vào CRISPR-dCas9, trong đó CARGO hệ thống yêu cầu ít nhất 12 cái sgRNAs hàng ngũ, mỗi cái sgRNA yêu cầu đơn độc U6 khởi động tử khống chế sang băng, cuối cùng lắp ráp ở một cái chất viên vật dẫn, dẫn tới chế bị quá trình phức tạp, mà mỗi cái sgRNA biểu đạt lượng đều một lần cũng vô pháp bảo đảm. CRISPRdelight là căn cứ vào CRISPR-dCas12a, đầy đủ lợi dụng Cas12a có thể xử lý đến từ CRISPR hàng ngũ trung đơn cái sang băng bổn nhiều sgRNAs, đơn giản hoá sgRNA hàng ngũ chế bị quá trình, bảo đảm sgRNA hàng ngũ đều một tính, cực đại mà đề cao căn cứ vào CRISPR DNA thành tượng hiệu suất cùng độ nhạy.

Gien ở nhân tế bào nội định vị cùng động thái biến hóa cùng gien sang băng hoạt tính cùng sang băng sau gia công quan hệ vẫn luôn bội số chú ý. Hạch đốm ( Nuclear speckles ) cùng gien hoạt tính có quan hệ, giàu có đại lượng RNA cắt nối ước số, bị cho rằng tham dự cắt nối công năng cùng điều tiết khống chế. Thông qua CRISPRdelight hệ thống phát hiện có ở trong chứa tử gien ở gien kích hoạt thời điểm sẽ trọng định vị đến hạch đốm mặt ngoài, làm cơ sở nhân sang băng cùng RNA cắt nối biên tập ngẫu nhiên liên cơ chế cung cấp tân chứng cứ, ám chỉ thông qua DNA trọng định vị sử tân sinh pre-mRNA bị vận chuyển ( sorting ) đến chia cắt máy móc phú tập hạch đốm tiến hành sang băng sau gia công.

Thông qua cùng RNA thích xứng thể ( RNA aptamers ) kết hợp, CRISPRdelight còn có thể trở thành nhiều sắc hệ thống dùng cho đồng thời quan sát nhiều DNA vị điểm, vì tiến thêm một bước nghiên cứu DNA hoàn hỗ trợ lẫn nhau ( DNA loop interactions ) tỷ như tăng cường tử - khởi động tử, tăng cường tử - tăng cường tử, khởi động tử - khởi động tử, khởi động tử - ngưng hẳn tử chờ hỗ trợ lẫn nhau và công năng đặt tốt đẹp cơ sở. Tiến thêm một bước thay đổi CRISPRdelight nhiều sắc hệ thống, tương lai cũng có thể ở sống tế bào trung kỳ tung hoàn đè ép ( loop extrusion ) quá trình. Xét thấy này rộng khắp ứng dụng tiền cảnh, CRISPRdelight hệ thống sẽ trở thành thúc đẩy 3d gien tổ học được tứ duy gien tổ học ( thời gian vì đệ tứ duy độ ) hữu lực công cụ chi nhất.

Nguyên văn liên tiếp:

https:// nature /articles/s41592-024-02333-3

Nguyên tiêu đề: 《【 tuyến đầu tiến triển 】 chuyên gia lời bình Nat Methods 丨 Trần Linh linh tổ lợi dụng CRISPR-dCas12 hệ thống thực hiện phi lặp lại gien tổ vị điểm cùng gien tổ vị điểm nhiều sắc đánh dấu 》

Đọc nguyên văn