• Chủ đề
Cao cấp tìm tòi >
Lịch sử tìm tòi Quét sạch lịch sử
Trang đầu> Tiếng Trung học vị >Chỉnh hợp H5N1 cúm gia cầm virus HA, NA lòng trắng trứng giả hình nghịch chuyển lục virus xây dựng cập ứng dụng
【6h】

Chỉnh hợp H5N1 cúm gia cầm virus HA, NA lòng trắng trứng giả hình nghịch chuyển lục virus xây dựng cập ứng dụng

Đại lý thu hoạch
Giao diện hướng dẫn
  • Mục lục
  • Trích yếu
  • Lục hạng
  • Tương tự văn hiến
  • Tương quan chủ đề

Mục lục

Thanh minh

Trích yếu

Lời nói đầu

1．H5N1 AIV bệnh truyền nhiễm học đặc điểm

2．H5N1 AIV phần tử sinh vật học đặc thù

3．H5N1 AIV vượt loại thuộc cảm nhiễm người cơ chế nghiên cứu

4． kháng H5N1 AIV dược vật nghiên cứu tình hình chung

5．H5N1 AⅣ vắc-xin phòng bệnh nghiên cứu tiến triển

Đệ nhất bộ phận Thâm Quyến người H5N1 cúm gia cầm virus chia lìa cây A／shenzhen／406H／06 gien đặc thù và di truyền tiến hóa phân tích

Tài liệu cùng phương pháp

Kết quả

Thảo luận

Đệ nhị bộ phận căn cứ vào giả virus kỹ thuật H5N1 cúm gia cầm bên ngoài cơ thể trung hoà thí nghiệm ngôi cao thành lập cập đánh giá

Tài liệu cùng phương pháp

Kết quả

Thảo luận

Tham khảo văn hiến

Nói khái quát

Công bác trong lúc phát biểu học thuật luận văn

Trí tạ

Triển khai ▼

Trích yếu

Mục đích: Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) (WHO) thống kê, tính đến 2011 năm 2 nguyệt 9 ngày, toàn cầu tích lũy báo cáo H5N1 hình cao thượng bệnh tính người cúm gia cầm ca bệnh 520 lệ, tử vong 307 lệ, tỷ lệ tử vong cao tới 59.0％; quốc nội báo cáo H5N1 hình cao thượng bệnh tính người cúm gia cầm ca bệnh 40 lệ, 14 lệ tồn tại. Trước mắt tuy rằng không có đầy đủ chứng cứ cho thấy người với người chi gian có thể lẫn nhau truyền bá, nhưng H5N1 cúm gia cầm virus (avian influenza virus, AIV) dễ dàng thông qua kháng nguyên trôi đi (antigen drift) hoặc dời đi (antigen shift) phát sinh biến dị, cấp H5N1 cúm gia cầm vắc-xin phòng bệnh nghiên cứu phát minh mang đến cực đại khiêu chiến. Nếu xuất hiện cúm gia cầm virus cùng dòng người cảm virus gien trọng tổ cây, hơn nữa tân độc cây đạt được người truyền người năng lực, nhân loại phổ biến đối này khuyết thiếu hữu hiệu miễn dịch bảo hộ lực, do đó dẫn phát thế giới mới đại lưu hành. 2006 năm chúng ta thông qua sử dụng thời kỳ dưỡng bệnh huyết tương liệu pháp thành công chữa khỏi 1 lệ trọng chứng H5N1 cúm gia cầm người bệnh, do đó khai sáng H5N1 người cúm gia cầm miễn dịch thụ động trị liệu khơi dòng. Mọi người ở nghiên cứu hoang dại hình H5N1 cúm gia cầm virus trong quá trình, thường thường gặp mặt lâm nguy hiểm tính cao, chu kỳ tính trường, thí nghiệm điều kiện hà khắc chờ rất nhiều nan đề, mà giả virus (pseudotyped virus) kỹ thuật hứng khởi vì giải quyết này loại vấn đề cung cấp một loại phi thường hữu hiệu nghiên cứu thủ đoạn. Bởi vậy, bổn nghiên cứu đầu tiên thông qua chia lìa Thâm Quyến A/Shenzhen/406H/06 virus cây, lợi dụng RT-PCR kỹ thuật clone HA, NA cùng NS gien, cũng đối này gien đặc thù, phần tử di truyền tiến hóa đặc điểm tiến hành thâm nhập phân tích; phân biệt xây dựng chỉnh hợp H5N1 cúm gia cầm A/Shenzhen/406H/06 cùng A/Thailand/KAN-1/04 độc cây HA, NA bao màng lòng trắng trứng giả hình nghịch chuyển lục virus, thông qua điện kính, miễn dịch dấu vết (Western-blot) kỹ thuật đối giả virus tiến hành giám định, thành lập căn cứ vào giả virus kỹ thuật bên ngoài cơ thể trung hoà thí nghiệm ngôi cao, vì bước tiếp theo người nguyên đơn clone trung hoà kháng thể sàng chọn cung cấp cường hữu lực kỹ thuật công cụ. Phương pháp: 1. Đem từ Thâm Quyến H5N1 cúm gia cầm người bệnh khí quản phân bố vật trung chia lìa virus dịch kinh 0.22μm lự màng lọc sau, cảm nhiễm 10cm khay nuôi cấy trung 4×106 cái MDCK tế bào, 48h sau thu thập tế bào thượng thanh dịch, lấy 20％ đường mía lót đế 70000×g siêu nhanh rời tâm 3h tiến hành virus áp súc, sử dụng Trizol thuốc thử lấy ra virus RNA. Dị Bính thuần lắng đọng lại RNA sau hòa tan 15μL vô RNA môi diệt khuẩn trong nước, tử ngoại phân trống trơn độ nghi trắc này độ dày (A260) cập độ tinh khiết (A260/A280). 2. Căn cứ A hình lưu cảm virus 8 cái gien đoạn ngắn 3' phía cuối 12 cái bảo thủ kiềm cơ danh sách thiết kế xoay ngược lại lục dẫn vật Uni12(5'-AGCAAAAGCAGG-3'), lấy 1μL virus RNA ở Uni12 cùng AMV xoay ngược lại lục môi dưới tác dụng hợp thành AIV gien tổ c-DNA kho sách. Thiết kế 3 đối nhằm vào HA, NA cùng NS gien đặc dị tính dẫn vật. Lấy 2μL xoay ngược lại lục sản vật cũng phân biệt sử dụng HA, NA cùng NS gien dẫn vật tiến hành khoách tăng, 3 cái gien đoạn ngắn phản ứng điều kiện đều vì:94℃ dự biến tính 2min, 94℃ biến tính 30s, 55℃ làm giảm độ cứng 45s, 72℃ kéo dài 2min, tuần hoàn 30 thứ, cuối cùng 72℃ kéo dài 7min. PCR sản vật dùng 1％ ( W/V ) rau câu đường ngưng keo điện vịnh kiểm tra đo lường. 3. Sử dụng DNA rau câu đường ngưng keo thuần hóa thuốc thử hộp thu về PCR sản vật, ở T4 liên tiếp môi dưới tác dụng cắm vào đến pGEM-T Easy vật dẫn, liên tiếp sản vật trực tiếp dùng cho chuyển hóa JM109 cảm thụ thái vi khuẩn, thông qua lam bạch đốm sàng chọn dương tính clone. Đem dương tính clone 37℃ qua đêm bồi dưỡng, lượng nhỏ trừu đề chất viên cùng sử dụng NotⅠ môi thiết giám định, lúc sau đưa Invitrogen công ty trắc tự giám định. 4. Từ GenBank trung thu hoạch đã công bố H5N1 hình HA, NA cùng NS gien Nucleotit danh sách cập suy luận axit amin danh sách, ứng dụng Cluster cập Mega3.1 phần mềm phân tích Thâm Quyến người chia lìa cây H5N1AIV HA, NA cùng NS trình tự gien đặc thù cập cùng nguyên tính, cũng vẽ này hệ thống phát dục tiến hóa thụ. 5. Thiết kế hai đoan phân biệt dẫn vào SalⅠ cùng BamHⅠ môi thiết vị điểm khoách tăng HA, NA gien đặc dị tính dẫn vật, lấy pGEM-T-HA, pGEM-T-NA chất viên làm khuôn mẫu tiến hành PCR khoách tăng, mục đích đoạn ngắn thu về sau sử dụng SalⅠ cùng BamHⅠ tiến hành song môi thiết, theo sau cùng đồng dạng môi thiết CMV/R chất viên tiến hành liên tiếp, chuyển hóa E.coliJM109 cảm thụ thái vi khuẩn sau chọn lấy dương tính clone chuyển hóa tử. 6. Chọn dùng canxi photphat cộng lắng đọng lại pháp đem pHR-Luc ( 14μg ), pCMV△8.2 ( 14μg ), CMV/R-HA ( 2μg ), CMV/R-NA(0.5μg) cộng 4 loại chất viên chuyển nhiễm đến 293T tế bào. Bởi vì VSV-G lòng trắng trứng có tác dụng rộng ký chủ phạm vi, cho nên dùng pHR-Luc, pCMV△8.2 cùng pVSV-G ba loại chất viên cộng chuyển nhiễm làm dương tính đối chiếu, mặt khác lấy pHR-Luc cùng pCMV△8.2 hai loại chất viên cộng chuyển nhiễm làm âm tính đối chiếu. Chuyển nhiễm 48h sau lấy tế bào thượng thanh, -80℃ đông lạnh tồn dự phòng. 7. Đem áp súc H5N1 cúm gia cầm giả virus hạt dùng hàm 2％ mậu nhị andehit PBS tiến hành cố định, sau đó hấp thụ ở khiết tịnh lưới đồng trung, 2％ lân wolfram toan Natri (pH=6.5) tiến hành phụ nhuộm màu lấy tiến hành điện kính quan sát. Đồng thời lấy áp súc sau giả virus, dựa theo văn hiến giới thiệu Western-blot phương pháp phân tích HA cập P24 biểu đạt. Trong đó HA một kháng vì H5N1AIV diệt sống cây miễn dịch chuột huyết thanh ( 1∶1000 pha loãng ), P24 một kháng vì chuột kháng P24 nhiều clone kháng thể ( 1∶1000 pha loãng ). Hai loại lòng trắng trứng nhị kháng đều vì kiềm tính axit phosphoric môi đánh dấu thỏ kháng chuột IgG ( 1∶3000 pha loãng ). 8. Giả virus cảm nhiễm trước 24h ở 24 khổng bản thượng phân biệt tiêm chủng 2×104 cái MDCK tế bào, phân biệt lấy 1000μL, 200μL, 40μL ba cái thang độ giả virus thượng thanh cảm nhiễm bia tế bào, mỗi cái thang độ thiết lập 3 cái phục khổng, cũng gia nhập Polybrene( chung độ dày vì 8μg/mL) xúc tiến virus hạt hấp thụ, cảm nhiễm 48h sau dựa theo kiểm tra đo lường cảm nhiễm tế bào cây trung báo cáo gien Luciferase tương đối hoạt tính (relative luciferase activity, RLA), do đó gián tiếp phán đoán giả virus cảm nhiễm hoạt tính. 9. Đem MDCK tế bào tiêm chủng với 24 khổng bản, 37℃, 5％CO2 bồi dưỡng qua đêm. Sử dụng PBS đem mỗi phân thời kỳ dưỡng bệnh huyết thanh từ 1∶10 bắt đầu tiến hành 2 lần thang độ pha loãng, cộng 12 cái thang độ, sau đó phân biệt ấn huyết thanh cùng virus 1∶1 thể tích so cùng 200μL Thâm Quyến cây ( hoặc Thái Lan cây ) giả virus hỗn hợp, cũng lấy cùng 40μVSV-G giả virus làm âm tính đối chiếu, 37℃ ấp trứng 2h, sau đó đem chất hỗn hợp gia nhập đến MDCK tế bào trung, 37℃ hấp thụ 2h sau hút bỏ chất hỗn hợp, tiếp tục bồi dưỡng 48h sau trắc định RLA. Lấy vô huyết thanh chặn tế bào khổng RLA làm chỗ trống đối chiếu giá trị, dựa theo dưới công thức tính toán huyết thanh đối giả virus cảm nhiễm ức chế suất: Cảm nhiễm ức chế suất = chỗ trống đối chiếu khổng RLA- chặn khổng RLA/ chỗ trống đối chiếu khổng RLA×100％ kết quả: 1.H5N1AIV RNA lấy ra và HA, NA cùng NS gien RT-PCR khoách tăng: Từ H5N1AIV trung lấy ra RNA kinh tử ngoại phân trống trơn độ nghi trắc định A260 vì 122.3μg/mL, A260/A280 vì 1.82, cho thấy RNA độ dày cập độ tinh khiết phù hợp nhu cầu. Lấy RNA vì khuôn mẫu chọn dùng hai bước pháp RT-PCR khoách tăng trở lên 3 cái gien đoạn ngắn, kinh 1％(W/V) rau câu đường ngưng keo điện vịnh biểu hiện khoách tăng đoạn ngắn lớn nhỏ phân biệt ước vì 1.7kb, 1.4kb cùng 800bp, cùng mong muốn lớn nhỏ tương xứng. 2.AIV HA, NA cùng NS gien clone cùng giám định:PCR sản vật thuần hóa sau dựa theo thường quy phương pháp cùng pGEM-T Easy vật dẫn tiến hành liên tiếp, chuyển hóa, dùng NotⅠ ( mục đích đoạn ngắn clone vị điểm hai sườn đều có NotⅠ môi thiết vị điểm ) môi thiết giám định, kết quả phân biệt xuất hiện cùng pGEM-T Easy vật dẫn (3.0kb) cùng mong muốn khoách tăng đoạn ngắn lớn nhỏ bằng nhau điều mang. Đem virus này cây 3 cái gien đoạn ngắn trọng tổ chất viên đưa Invitrogen công ty trắc tự giám định, độc cây mệnh danh là A/Shenzhen/406H/06, cũng đã đăng nhập đến GenBank, HA, NA, NS gien đánh số phân biệt vì EF137706, EF137708, EF137710. 3.H5N1AIV HA, NA, NS trình tự gien đặc thù:HA gien mã hóa 567aa, HA lòng trắng trứng phân tách vị điểm axit amin tạo thành vì SPLRERRRKR↓GLF. Cùng với nó virus cây HA lòng trắng trứng danh sách so sánh, nên độc cây ở chịu thể kết hợp vị điểm Tyr91, Trp149, Ile151, His179, Asn182, Leu190, Gln192 cùng với 130～134(GVSSA) cùng 220～224(NGQSG) chờ vị điểm tương đương bảo thủ. HA lòng trắng trứng người trung gian để lại truyền thống 7 cái đường cơ hóa vị điểm, mặt khác xuất hiện Ala156Thr đột biến, do đó ở Asn154 gia tăng rồi một cái tiềm tàng đường cơ hóa vị điểm. NA gien mã hóa 449aa, thứ nhất cấp kết cấu bao gồm gốc amin đoan bào tương đuôi, phi tính có cực vượt màng khu, hành bộ cùng phần đầu cộng 4 cái kết cấu vực. Cùng H1N1AIV tiến hành so đối, phát hiện A/Shenzhen/406H/06 ở 49～68 vị thiếu hụt 20 cái axit amin, do đó dẫn tới NA hành bộ mất đi 4 cái tiềm tàng đường cơ hóa vị điểm (NQS, NNT, NQT, NIS). NS gien đựng 2 cái mở ra đọc mã khung, mã hóa NS1 cùng NS2 lòng trắng trứng. NS1 từ 225aa tạo thành, cùng A/Hongkong/156/97 tiến hành so đối phát hiện ở 80～84 vị phát sinh axit amin thiếu hụt. 4.H5N1AIV HA, NA, NS gien hệ thống tiến hóa thụ vẽ: Căn cứ HA gien AIV nhưng chia làm hai đại hệ thống gia phả: Bắc Mỹ hệ thống gia phả cùng Âu Á hệ thống gia phả, trong đó Âu Á hệ thống gia phả đại khái chia làm 4 cái phân chi, tức Trung Quốc nội địa phân chi, thanh hải phân chi, 02/03 Hong Kong phân chi cùng 97 Hong Kong phân chi. A/Shenzhen/406H/06 ở vào Âu Á hệ thống gia phả Trung Quốc nội địa phân chi thượng. NA gien chia làm tam đại hệ thống gia phả, tức kinh điển heo nguyên hệ thống gia phả, người nguyên hệ thống gia phả, cầm nguyên hệ thống gia phả. A/Shenzhen/406H/06 thuộc về cầm nguyên hệ thống gia phả. NS gien nhưng chia làm chờ vị gien A đàn cùng B đàn. A/Shenzhen/406H/06 thuộc về chờ vị gien B đàn, cùng A/Dk/Fu gian /1734/05 cùng A/Dk/Hunan/191/05 ở vào cùng tiến hóa phân chi thượng, này Nucleotit cùng nguyên tính phân biệt vì 98.3％ cùng 94.8％. 5.CMV/R-HA, CMV/R-NA biểu đạt vật dẫn xây dựng cập giám định: Lấy pGEM-T-HA, NA vật dẫn vì khuôn mẫu tiến hành PCR khoách tăng, đồng thời ở khoách tăng đoạn ngắn hai đoan phân biệt dẫn vào SalⅠ cùng BamHⅠ môi thiết vị điểm, khoách tăng đoạn ngắn lớn nhỏ cùng mong muốn lớn nhỏ tương xứng. Khoách tăng đoạn ngắn cùng CMV/R vật dẫn liên tiếp sau, trải qua môi thiết giám định sinh ra cùng CMV/R không vật dẫn (4.0Kb) cùng mục đích đoạn ngắn lớn nhỏ nhất trí điều mang, do đó chứng minh HA, NA gien thành công clone đến CMV/R vật dẫn. 6.H5N1 cúm gia cầm giả virus điện kính quan sát: Bởi vì giả virus hệ thống là từ chậm virus vật dẫn xây dựng mà đến, này y xác lòng trắng trứng nơi phát ra với HIV-1 gag, mà bao màng lòng trắng trứng tắc từ HA, NA thay thế gp120, bởi vậy này virus hạt đường kính hẳn là cùng HIV-1 gần, ước 100nm. Mặt khác giả virus hạt phân bố với virus nẩy mầm, phóng thích chờ các giai đoạn, cùng hoang dại hình virus sinh hoạt chu kỳ phi thường tương tự. 7.H5N1 cúm gia cầm giả virus HA, P24 lòng trắng trứng Western-blot giám định: Đem phân tách sau giả virus dùng H5N1AIV diệt sống cây miễn dịch chuột huyết thanh tiến hành ấp trứng, ở Thâm Quyến cây, Thái Lan cây giả virus đường bơi trung xuất hiện 3 điều điều mang, từ trên xuống dưới phân tử lượng ước vì 80×103, 55×103 cùng 25×103, phân biệt cùng HA trước thể lòng trắng trứng HA0, HA0 phân tách sau hình thành HA1 cùng HA2 lòng trắng trứng lớn nhỏ tương xứng, nhắc nhở giả virus mặt ngoài chỉnh hợp H5N1AIV HA lòng trắng trứng, mà đối với chỉ chuyển nhiễm pHR-Luc cùng pCMV△8.2 hai loại chất viên âm tính đối chiếu tắc chưa xuất hiện HA điều mang. Mà đem phân tách virus cùng chuột kháng P24 nhiều clone kháng thể phân biệt tiến hành ấp trứng, tắc Thâm Quyến cây, Thái Lan cây giả virus cùng với âm tính đối chiếu đều xuất hiện P55, P41 cùng P24 cộng 3 điều điều mang, nhắc nhở ba loại tế bào thượng thanh trung đều tồn tại HIV virus dạng hạt (virus-like particle,VLP). 8.H5N1 cúm gia cầm giả virus cảm nhiễm hoạt tính: Thâm Quyến cây, Thái Lan cây giả virus đều có cảm nhiễm hoạt tính, hiệu giới hơi thấp với làm dương tính đối chiếu chỉnh hợp VSV-G lòng trắng trứng giả virus, 200μL giả virus thượng thanh cảm nhiễm MDCK tế bào sau RLA giá trị ước vì 2×104, rõ ràng cao hơn chỉ chuyển nhiễm pHR-Luc cùng pCMV△8.2 hai loại chất viên âm tính đối chiếu ( chưa chỉnh hợp HA, NA lòng trắng trứng HIV virus dạng hạt ). 9. Căn cứ vào giả virus kỹ thuật bên ngoài cơ thể trung hoà thí nghiệm ngôi cao thành lập: Đem 12 cái thang độ pha loãng Thâm Quyến cùng An Huy huyết thanh phân biệt cùng Thâm Quyến cây, Thái Lan cây giả virus tiến hành trung hoà phản ứng, cũng lấy VSV-G giả virus làm âm tính đối chiếu, Thâm Quyến thời kỳ dưỡng bệnh huyết thanh đối tự thân chia lìa Thâm Quyến cây giả virus RLA giá trị 50％ ức chế độ dày (IC50) ước vì 1∶10240, mà đối Thái Lan cây giả virus trung hoà hiệu giới lộ rõ thấp hơn Thâm Quyến cây, IC50 xen vào 1∶160～320, mà đối VSV-G giả virus cơ bản vô trung hoà năng lực. An Huy thời kỳ dưỡng bệnh huyết thanh đối Thâm Quyến cây giả virus trung hoà hiệu giới cao hơn Thái Lan cây, trong đó đối Thâm Quyến cây giả virus IC50 xen vào 1∶5120～10240, thấp hơn Thâm Quyến người bệnh tự thân thời kỳ dưỡng bệnh huyết thanh trung hoà năng lực (1∶10240); mà đối Thái Lan cây giả virus IC50 xen vào 1∶2650～5120, tắc lộ rõ cao hơn Thâm Quyến thời kỳ dưỡng bệnh huyết thanh. Kết luận: 1.A/Shenzhen/406H/06HA lòng trắng trứng phân tách vị điểm đựng nhiều liên tục kiềm tính axit amin, cụ bị cao thượng bệnh tính độc cây gien đặc thù, mặt khác Ala156Thr đột biến dẫn tới ở Asn154 gia tăng một cái tiềm tàng đường cơ hóa vị điểm, có thể là ảnh hưởng AIV độc lực một khác quan trọng nhân tố. NA lòng trắng trứng hành bộ thiếu hụt 49～68aa có thể dẫn tới H5N1AIV độc lực giảm xuống, NS1 lòng trắng trứng 80～84aa thiếu hụt nhưng dẫn tới H5N1AIV kháng quấy nhiễu tố năng lực giảm xuống, nhưng HA156 vị tân tăng tiềm tàng đường cơ hóa vị điểm tướng đền bù trở lên thiếu hụt gây ra mặt trái tác dụng, do đó làm này phục chế

Lục hạng

Tương tự văn hiến

  • Tiếng Trung văn hiến
  • Ngoại văn văn hiến
  • Độc quyền
Đại lý thu hoạch

Khách phục hộp thư: kefu@zhangqiaokeyan

Kinh công võng an bị: 11010802029741 hào ICP lập hồ sơ hào:Kinh ICP bị 15016152 hào -6 Sáu duy liên hợp tin tức khoa học kỹ thuật ( Bắc Kinh ) công ty hữu hạn © bản quyền sở hữu

  • Khách phục WeChat

  • Phục vụ hào